[发明专利]一种构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法及应用

权利要求书

1.一种构建Fzd6基因敲除小鼠模型的方法，其特征在于，包括：

（1）确定小鼠待敲除基因的特异性靶位点，针对小鼠Fzd6基因的第四个外显子设计sgRNA序列，所述的特异性的sgRNA序列为SEQ ID NO.1；

（2）使用所述的sgRNA构建sgRNA/Cas9表达载体；

（3）将所述的sgRNA/Cas9表达载体线性化并纯化后，体外转录合成sgRNA和Cas9 mRNA；

（4）将上述sgRNA和Cas9 mRNA一起显微注射到小鼠的受精卵中；

（5）将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠中，出生的小鼠即F0代小鼠，通过PCR反应和Sanger测序确认是野生型小鼠或阳性杂合子小鼠；

（6）取鉴定后的F0代野生型小鼠和阳性杂合子小鼠进行回交，获得单一基因型的杂合子小鼠，然后在杂合子小鼠之间杂交繁育获得纯合子个体，此即所构建的Fzd6基因敲除小鼠模型。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，（2）中构建sgRNA/Cas9表达载体，具体为：

（1）对sgRNA序列设计特异性引物，包括sgRNA正向引物和sgRNA反向互补引物；

（2）将设计好的 sgRNA以梯度降温的方式退火成双链后与质粒连接、转化、涂板，然后置于37℃细菌培养箱中孵育过夜，第二天挑取单克隆并接种于LB 培养液中，在37℃恒温摇床中培养过夜，之后收集菌液进行质粒提取，同时进行PCR鉴定阳性克隆。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA正向引物序列为SEQ IDNO.2，sgRNA反向互补引物序列为SEQ ID NO.3。

4.构建Fzd6基因敲除小鼠模型的试剂盒，其特征在于，含有sgRNA，所述sgRNA序列为SEQ ID NO.1。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还含有Cas9 mRNA。