[发明专利]一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用

说明书

本发明公开了一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用。所述提取方法包括：将所述含外泌体的样本溶液与亲和液充分混合置于第一储存罐中，打开开关K2，断开开关K1、K3，开启第一蠕动泵，流经Reprotidesupgt;TM/supgt;511蛋白交联纳米亲和微球柱，循环流动；对Reprotidesupgt;TM/supgt;511蛋白交联纳米亲和微球柱进行洗涤、洗脱后；打开开关K1，关闭开关K3、K2，将溶液泵入第二储存罐中，打开第二蠕动泵，让溶液经过滤装置，循环浓缩过滤至最小运行体积；加入无菌PBS缓冲液，循环浓缩过滤，即得提取纯化的外泌体溶液。本发明可用于大体积复杂样本外泌体提取制备，操作方便，提取效率高，外泌体纯度高，产量多，生物学活性高，可实现复杂样本外泌体的批量自动化提取，具有极大的商业价值。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用。

背景技术

外泌体是有活细胞分泌的磷脂双分子层结构的小囊泡，直径在30-150nm，可存在于各种体液中，如血清、血浆、唾液、尿液，腹水、脊髓液、乳汁等。外泌体中含有多种生物分子，如mRNA、miRNA、蛋白质、脂质等，可以传递给受体细胞，从而改变受体细胞的生理功能或病理功能。近几年，外泌体作为细胞间的信息传递工具及各种疾病的生物标志物而引起广泛的关注，外泌体具有在生物医药及疾病诊断领域的应用开发潜力。

针对外泌体的提取纯化没有一个统一的标准，常用的方法有很多种，超速离心法、密度梯度离心法，超滤法，聚合物沉淀法，免疫捕获法等。超速离心法虽然是公认的外泌体提取的“金标准”方法，但是操作费时费力、高度依赖人工，回收率低，外泌体形态大小不一，高速离心会损害外泌体而影响下游实验。密度梯度离心法虽然可以获得很纯的外泌体，但该方法操作繁琐，重复性差，耗时很长，回收率低，不适合大批量提取外泌体。超滤法可以方便快速的提取外泌体，但该方法提取的外泌体中含有大颗粒杂质污染，严重影响下游应用。聚合物沉淀法提取的外泌体中杂蛋白污染多，颗粒形态不均一，影响下游分析。免疫捕获法虽然可以特异性地捕获外泌体，获得的外泌体纯度高，但该方法成本高且产量低，不能提取样本中所有的外泌体，只能提取某种表面抗原阳性的外泌体。但是，血清，血浆，牛奶等成分复杂的样本，由于溶液中含有大量的颗粒物质，如载脂蛋白，脂颗粒等，可对外泌体造成严重污染，而目前的众多方法中，还没有针对此类样品的外泌体批量提取方法。

综上所述，急需一种操作方便，提取效率高，获得的外泌体纯度高，可以适合大体积复杂样本的外泌体提取纯化方法。

发明内容

为此，本发明提供一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用，以解决现有技术中操作复杂、提取效率低、样本量小、提取的外泌体纯度低、重复性差等问题。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

根据本发明的第一方面提供的一种用于外泌体提取的亲和切向流过滤系统，所述过滤系统包括：第一储存罐、第二储存罐、Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球柱、过滤装置、第一蠕动泵、第二蠕动泵和三个开关K1、K2、K3；

其中，第一储存罐的出口经第一蠕动泵与Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球柱的入口连接，Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球柱的出口分别通过开关K1、K2、K3的开闭来控制柱内的液体流向，其中开关K1、K2关闭时，开开关K3，液体流出体系，开关K1、K3关闭时，开开关K2，液体循环流回第一储存罐，开关K2、K3关闭时，开开关K1，液体经第二储存罐的入口进入第二储存罐；第二储存罐的出口经第二蠕动泵与过滤装置的入口连接，过滤装置的出口与第二储存罐的第二入口连接，经过滤装置过滤后的液体直接流出体系；

其中，所述过滤装置是设有切向流过滤膜F的过滤体系，所述切向流过滤膜F的截留分子量为50-750kD。