[发明专利]一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用

权利要求书

1.一种应用亲和切向流过滤系统提取外泌体的方法，其特征在于，过滤系统包括：第一储存罐、第二储存罐、Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球柱、过滤装置、第一蠕动泵、第二蠕动泵和三个开关K1、K2、K3；

其中，第一储存罐的出口经第一蠕动泵与Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球柱的入口连接，Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球柱的出口分别通过开关K1、K2、K3的开闭来控制柱内的液体流向，其中开关K1、K2关闭时，开开关K3，液体流出体系，开关K1、K3关闭时，开开关K2，液体循环流回第一储存罐，开关K2、K3关闭时，开开关K1，液体经第二储存罐的入口进入第二储存罐；第二储存罐的出口经第二蠕动泵与过滤装置的入口连接，过滤装置的出口与第二储存罐的第二入口连接，经过滤装置过滤后的液体直接流出体系；

其中，所述过滤装置是设有切向流过滤膜F的过滤体系，所述切向流过滤膜F的截留分子量为50-750kD；

所述方法包括以下步骤：

步骤一，将样本溶液进行预处理，得含外泌体的样本溶液；

步骤二，将所述含外泌体的样本溶液与亲和液充分混合，并置于第一储存罐中，打开开关K2，断开开关K1、K3，开启第一蠕动泵，让溶液流经Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球柱，并循环流动2-5h；

步骤三，断开开关K1、K2，打开开关K3，将第一存储罐的液体排出后，再向第一存储罐中加入洗涤液，冲洗后洗涤液排出；

步骤四，打开开关K2，关闭开关K3、K1，向第一储存罐中加入洗脱液进行洗脱，循环洗脱反应20-60min；

步骤五，打开开关K1，关闭开关K3、K2，将溶液泵入第二储存罐中，打开第二蠕动泵，让溶液经过滤装置，循环浓缩过滤至最小运行体积；加入无菌PBS缓冲液，循环浓缩过滤，即得提取纯化的外泌体溶液；

所述Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球柱为蛋白交联纳米亲和微球为蛋白与纳米微球偶联物的结合体；其中，所述蛋白为生物素标记的Reprotide^TM511蛋白；所述纳米微球偶联物为链霉亲和素偶联的直径为200-2000nm的纳米羧基硅胶微球；将制备的Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球装入色谱柱，并盖上顶盖，制得Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球柱；

所述Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球的制备方法包括以下步骤：将Reprotide^TM511蛋白加入活性生物素，4℃孵育1-24h，再用脱盐柱去除游离的生物素，用PBS缓冲液洗脱，得到生物素标记的Reprotide^TM511蛋白；再将生物素标记的Reprotide^TM511蛋白加入链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球中，反应0.5-3h后，离心得沉淀，所述沉淀即为Reprotide^TM511蛋白交联纳米亲和微球；

所述链霉亲和素偶联的纳米羧基硅胶微球的制备方法为：将DMF（N,N-二甲基甲酰胺）加入MES缓冲液洗涤纳米羧基硅胶微球中，充分混匀得到混合液；将1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐加入N-羟基琥珀酰亚胺加入所述混合液中，混匀，离心弃上清，得第一沉淀物；将所述链霉亲和素溶液加入第一沉淀物中，室温混合，离心，得第二沉淀物；将封闭液加入到所述第二沉淀物中，混合反应，离心，得到链霉亲和素偶联纳米羧基硅胶微球；

所述亲和液包括HEPES、CaCl₂、NaCl和MgCl₂；所述洗涤液包括Tris-HCl、NaCl、CaCl₂和MgCl₂；所述洗脱液包括Tris-HCl、NaCl和EDTA。

2.根据权利要求1所述一种应用亲和切向流过滤系统提取外泌体的方法，其特征在于，所述样本预处理的方法是将样本加入离心管中，5000-12000g，离心5-50min，取上清液，过0.22-0.45μm滤膜过滤除菌。