[发明专利]一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法

说明书

本发明公开了一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法，包括使用流式细胞分选仪进行外泌体分选，使用50μm空气喷射喷嘴，鞘液的压力为75‑80.5psi，样品流的压力与鞘液的压力差值为0.3‑0.6psi；阈值设置为0.01；利用聚苯乙烯珠，标定粒径为50nm、100nm、200nm和500nm的外泌体颗粒的位置；利用流式细胞仪分离纯化50‑200nm粒径的外泌体颗粒。本发明的方法能够得到50‑200nm的外泌体，粒径范围更小，不含其他粒径范围，纯度高。

技术领域

本发明属于纳米生物颗粒获取领域，具体涉及一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法。

背景技术

细胞释放出不同大小的细胞外囊泡(EVs)，因其运载的信号分子及膜内含物在细胞间通讯发挥了重要作用，越来越受到研究者的重视。据文献报道(Exosomes andEctosomes in Intercellular Communication；2019 cell-Reassessment of ExosomeComposition)，大小不同的外囊泡的作用也不同，其中50-150nm由内小体(Exosomes)衍生的小胞外囊泡(SEVS)可以精确地将RNA、DNA和蛋白质分配到正确的细胞外，并确定它们的分泌机制，对于识别生物标志物和设计未来的药物干预措施至关重要。

另外，粒径、浓度等物理参数，是评估外泌体分离的主要指标之一，随着外泌体在临床应用的不断研究，对外泌体分离方法及检测手段提出了更高的要求。

目前常用的分离方法有超速离心法、尺寸排阻法及聚合物沉淀法等，但不同分离纯化方法得到的外泌体粒径参数不一致。已有文献表明，超速离心法提取的外泌体颗粒主要在40-500nm之间，粒径大小均有分布；尺寸排阻法提取的外泌体颗粒主要在40-120nm之间，以小粒径颗粒居多；聚合物沉淀法提取的外泌体主要分布在40-100nm之间，只有极少数分布在100nm以上，大粒径的颗粒较少。以上方法均无法获取50-200nm之间(含50-150nm)的小胞外囊泡，一定程度上影响下游实验的开展，因此纯化分离特定粒径区间的外囊泡是亟待解决的问题。

流式细胞仪能够对细胞及细胞大小的生物颗粒进行定量表征，入射激光束逐个照射液流系统中的细胞或颗粒，由高灵敏度检测器接收散射光及其他荧光信号后，完成多参数分析，例如颗粒的形状及大小。对于相同折射率的颗粒及其悬浮介质，其散射光通常与颗粒大小有关，现有的灵敏型流式细胞仪散射光范围通常在300-500nm之间。然而，外泌体因粒径小，通常位于其背景噪声之内，常规方法无法对其进行分析及分选。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法，包括以下步骤：

(1)设置仪器参数和选择配件：使用MoFlo Astrios EQ流式细胞分选仪进行外泌体分选，使用50μm空气喷射喷嘴(Jet-in-air)，鞘液的压力为75-80.5psi，样品流的压力与鞘液的压力差值为0.3-0.6psi；阈值设置为0.01；

在流式分选中，不同大小的空气喷射喷嘴需要不同鞘液压力来维持液流的稳定，本发明中用50μm的喷嘴，只有大于或等于80psi的鞘液压力才能维持液流稳定。

样品流和鞘液的压力差决定分选的上样速度，在本发明设置条件下(样品流的压力与鞘液的压力差值为0.3-0.6psi)，液流较稳定，且上样速度使分选效率达到较高水平。如果设置其他数值，会对以上两方面有影响。

(2)利用聚苯乙烯珠，标定粒径为50nm、100nm、200nm和500nm的外泌体颗粒的位置；

(3)利用流式细胞仪分离纯化50-200nm粒径的外泌体颗粒。