[发明专利]一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法

权利要求书

1.一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)设置仪器参数和选择配件：使用流式细胞分选仪进行外泌体分选，使用50μm空气喷射喷嘴，鞘液的压力为75-80.5psi，样品流的压力与鞘液的压力差值为0.3-0.6psi；阈值设置为0.01；

(2)利用聚苯乙烯珠，标定粒径为50nm、100nm、200nm和500nm的外泌体颗粒的位置；

(3)利用流式细胞仪分离纯化50-200nm粒径的外泌体颗粒。

2.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法，其特征是，步骤(1)中，设置仪器参数时，前向角和侧向角使用对数参数。

3.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法，其特征是，步骤(3)中，使用聚苯乙烯珠的稀释液，其中稀释倍数为1:1000。

4.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法，其特征是，步骤(1)中，鞘液压力设置为80psi。

5.根据权利要求1所述的一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法，其特征是，在步骤(1)之前，还包括获得外泌体混合液的步骤。

6.根据权利要求5所述的一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法，其特征是，所述获得外泌体混合液的步骤为：采用超速离心法从细胞上清液中获得外泌体混合液。

7.根据权利要求6所述的一种利用流式细胞分选仪获取指定粒径外泌体的分离纯化方法，其特征是，所述获得外泌体混合液的步骤为：

P4代PANC-1细胞的融合度为75％时，用浓度为0.01M，pH为7.2-7.4的磷酸缓冲溶液润洗PANC-1细胞，加入含体积分数10％无外泌体的胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养48h后收集细胞上清液，采用超速离心法从细胞上清液中获得外泌体混合液：

4℃，300×g离心10min，取上清液；然后再2 000×g离心10min，取上清液；再10 000×g离心30min，取上清液；再100 000×g离心70min，取沉淀，加入PBS缓冲液洗涤沉淀，100 000×g离心70min，取沉淀，用PBS缓冲液重悬得到外泌体混合液。