[发明专利]一种基于铁死亡进程的肝细胞癌分型体系的构建方法

权利要求书

1.一种基于铁死亡进程的肝细胞癌分型体系的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一、探索FRGs在HCC中的表达情况：首先分别纳入来自于GEO，TCGA和ICGC数据库的32个数据集共3933个肝细胞癌样本，且32个数据集分别为GSE102079，GSE107170，GSE109211，GSE112790，GSE116174，GSE121248，GSE14323，NCI，GSE16757，GSE19977，GSE20017，GSE25097，GSE36376，GSE36411，GSE39791，GSE43619，GSE45436，GSE46444，GSE50579，GSE54236，GSE57957，GSE62043，GSE62232，GSE63898，GSE64041，GSE76297，GSE76427，GSE84005，GSE87630，GSE9843，TCGA-LIHC和ICGC-LIRI-JP，其中NCI TCGA-LIHC和ICHC-LIRI-JP具有完整的表达信息和临床预后信息；

然后再采用affy软件包中的rma函数对来自Affymetrix平台的原始数据进行标准化，来自其他平台的数据直接下载标准化过的矩阵文件，之后再使用SVA包中的combat算法进行批次矫正，TCGA-LIHC队列的RNA-seq数据从UCSC-Xena数据库获得，并进一步转化为log2(TPM+1)，ICGC-LIRI-JP数据集的RNA-seq数据直接从ICGC数据门户网站获得，随后，再对训练集和验证集的表达数据均转化为z-scoring，相应的临床和样本信息从GEO，UCSC和ICGC数据库中获得，对于TCGA-LIHC中的体细胞突变数据、拷贝数变异数据和DNA甲基化数据均从TCGA门户网站下载，此外，从Thorsson等人的研究中计算或招募了肿瘤突变负荷、单核苷酸变异和插入缺失新抗原负荷、微卫星不稳定性、癌睾丸抗原评分和TCR/BCR多样性等进行后续研究；

步骤二、异质性铁死亡亚型的识别和验证：接着再将来自于30个GEO发现队列的共3327个样本作为发现队列，并通过ConsensusClusterPlus软件包进一步分为k组(k＝2～9)，根据共识得分的CDF曲线，我们发现k＝2是最优选择，之后，再应用PAC和NbClust两种方法进行验证并得到了相同的结果，基于74个FRGs的表达，这两个亚型的样本在二维主成分图上显著分离，为了确保GEO发现队列聚类结果的可靠性和稳定性，进一步在TCGA和ICGC两个验证队列进行了IGP分析，结果显示，TCGA队列中C1的IGP值为90.3％，C2的IGP值为92.9％，而ICGC队列中C1的IGP值为88.4％和91.7％(所有p0.001)，与此一致的是NbClust也表明，在两个队列中分为两个亚型是最理想的，因此，根据聚类结果，最终将肝细胞癌样本分为C1和C2两种亚型；

过程中发现多数FRGs在C2明显上调，而C1则相反，从而铁死亡可以诱导肿瘤特异性免疫反应，增强免疫治疗的效果，进一步的相关性分析也提示HCC中74个FRGs的表达和TME细胞的浸润丰度之间存在强烈的相关性，进一步探索了TME细胞在两种亚型的浸润差异，结果显示C1的总体浸润水平较高，除了丰富的免疫激活细胞，C1还显示出更高丰度的免疫抑制细胞；

为进一步明确两种亚型的生物学特征，分别利用Hallmark和KEGG基因集进行GSVA富集分析，C1明显富集在炎症相关通路中，如同种异体移植排斥反应、炎症反应和T细胞受体信号通路；而C2主要与代谢相关通路密切相关，包括氧化磷酸化、脂肪酸代谢、胆汁酸代谢和氨基酸代谢，之后从TCGA和ICGC两个验证队列也获得了相似的结果，综合以上结果，我们定义两种分子亚型如下：1)高免疫低代谢型(C1)：低水平的FRGs表达和炎症相关通路的富集以及高丰度的免疫细胞浸润；2)高代谢低免疫型(C2)：高水平的FRGs表达和代谢相关通路富集以及低丰度的免疫细胞浸润；

步骤三、两亚型的临床状态：然后再用Kaplan-Meier对两亚型样本进行生存分析，结果显示C2的OS和RFS优于C1，研究表明，案例可以通过抑制Xc^-系统诱导铁死亡，使用pRRophetic软件包预测了两种亚型对索拉非尼的敏感性，结果提示C2更有可能从索拉非尼的治疗中获益，此外，之前的分析显示C1具有较丰富的免疫细胞浸润，免疫检查点分子(如PD-L1和CTLA-4)也在C1中过度表达，结果均表明C1可能对免疫治疗更敏感，因此，再进一步评估了免疫治疗对两种亚型的有效性，使用TIDE网页工具，C1的反应高于C2，在TCGA和ICGC两个验证队列中也获得了相似的结果，同时还利用GenePattern平台的Submap算法来评估两种亚型和47例接受全面免疫治疗的患者的表达谱的相似性，结果表明C1与抗PD-1治疗有效的患者显著相关，之后我们在两个验证队列中也获得了相似的结果，此外，我们还观察到C1亚型患者与年龄小于65岁、女性、较晚的AJCC分期、较高的肿瘤分级以及血管侵犯显著相关，两种亚型之间的BMI没有显著差异；

步骤四、评估FRRS在预测预后和免疫治疗疗效上的表现：在DEGs、SMGs、CAGs和ESGs四个不同来源的显著基因中，再挑选至少2/4来源的33个基因进行进一步研究，单因素COX回归分析表明，6个基因具有显著的预后意义(p0.05)，接下来，再纳入了这6个基因(p0.05)进行多因素COX回归分析，采用逐步回归替代法，基于最小的AIC值，确定最佳模型：FRRS＝0.348*Expression(SLC16A3)-0.151*Expression(CPS1)，生存分析显示高FRRS患者的预后更差，一致性指数分析也证实，FRRS在TCGA、ICGC和NCI的三个独立队列中具有较高的准确性，结合临床因素，我们通过多因素Cox回归分析观察到FRRS是HCC的独立预后因素；

探索与免疫治疗反应有关的FRRS的生物学特征后，发现FRRS与HAVCR2、CTLA4和PDCD1等ICP分子的表达，以及Treg细胞和MDSC的浸润模式呈显著正相关，因此，再纳入了3个免疫治疗队列，以进一步研究FRRS是否可以预测患者对免疫治疗的反应性，与上述一致，高FRRS患者在这三个队列中均显示出了不利的生存期，此外，临床上对免疫治疗起反应的患者也展现出更低的FRRS，表明FRRS较低的患者更有可能从免疫治疗中获益，采用ROC曲线的曲线下面积(AUC)评估FRRS预测免疫治疗反应的准确性，这些结果强烈提示FRRS是一个可靠的生物标志物，然后，再计算7种广泛使用的免疫治疗生物标志物，包括TMB、TIDE、MSI评分、Merck18、IFGN、CD8和CD274，在所有三个队列中，FRRS在预测免疫治疗方面提供了更高的准确性，值得注意的是，虽然在FRRS在GSE78220队列中的预测能力比TIDE略低，但TIDE在预测IMvigor210队列和GSE100797队列对免疫治疗的反应方面表现更差，综上，研究强有力地证实了FRRS可用来评估肿瘤的免疫治疗反应和预测患者的预后，并且优于当前广泛使用的生物标记物；

步骤五、HCCS程序包的开发：基于质心法和皮尔森关联性分析，开发了名为HCCS的R程序包，HCCS中的ferroptosis_phenotype可以将数据中的HCC样本划分到对应的铁死亡亚型C1或C2，并计算每个样本的FRRS，进一步可以预测患者的预后和评估患者的免疫治疗疗效，从而更好地服务于临床。