[发明专利]一种树突状细胞疫苗、制备方法及应用

权利要求书

1.一种树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述树突状细胞疫苗的制备方法包括以下步骤：

步骤一，对小鼠树突状细胞进行培育并使用培育的树突状细胞进行转染环状RNAAEBP2的树突状细胞的制备：利用体外培养对小鼠树突状细胞进行培育，在培育至第5天时，将未成熟的树突状细胞转染环状RNAAEBP2的质粒；所述将未成熟的树突状细胞转染环状RNAAEBP2的质粒的时间为40～48h；照射放射线，使环状RNAAEBP2过表达，得到成熟度高的转染环状RNAAEBP2的树突状细胞；

步骤二，黑色素瘤细胞抗原制备：选取多形性胶质母细胞瘤作为肿瘤组织；获取肿瘤组织，在体外对肿瘤组织进行原代培养和分离，得到肿瘤细胞；通过生物法和/或物理法裂解肿瘤细胞溶解产物，以流式细胞仪自肿瘤细胞筛选具有特定细胞表面抗原的癌干细胞，得到黑色素瘤细胞抗原；其中，所述生物法是采用抗肿瘤化疗药物对肿瘤细胞进行处理使肿瘤细胞凋亡；所述物理法是采用同位素射线照射肿瘤细胞使肿瘤细胞凋亡，或是采用紫外线照射肿瘤细胞使肿瘤细胞凋亡，或是采用反复冻融的方式对肿瘤细胞进行反复冻融使肿瘤细胞凋亡；

步骤三，进行树突状细胞和黑色素瘤细胞抗原的双基因共表达重组真核载体的构建：将步骤二制备的所述黑色素瘤细胞抗原加入到步骤一制备的所述转染环状RNAAEBP2的树突状细胞中，设定培养时间为36～48h进行共同培养；利用β-葡聚糖诱导树突状细胞摄取黑色素瘤细胞抗原，将黑色素瘤细胞抗原负载到树突状细胞内，构建得到树突状细胞和黑色素瘤细胞抗原的双基因共表达重组真核载体；

步骤四，使用树突状细胞和黑色素瘤细胞抗原的双基因共表达重组真核载体进行树突状细胞疫苗的制备：在步骤三构建得到的树突状细胞和黑色素瘤细胞抗原的双基因共表达重组真核载体中加入皂苷QuilA，后加入胆固醇及卵磷脂得到混合溶液；设定超声温度为25～28℃、超声频率为55～60kHz、超声时间为10～30min对混合溶液进行冰浴超声处理，使混合溶液充分混匀并乳化得到乳化分散液；对乳化分散液进行PBS透析，得到混合黑色素瘤细胞抗原的树突状细胞肿瘤疫苗。

2.如权利要求1所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述在体外对肿瘤组织进行原代培养和分离，得到肿瘤细胞，包括：

(1)获取肿瘤组织；

(2)用含GM-CSF和IL-4的培养基将肿瘤组织原代培养100～140h；

(3)利用分离机将原代培养得到的肿瘤组织进行分离，得到肿瘤细胞。

3.如权利要求2所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，所述含有GM-CSF和IL-4的培养基中，所述GM-CSF的浓度为80～120ng/mL，所述IL-4的浓度为30～70ng/mL。

4.如权利要求1所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述特定细胞表面抗原为CD133和CD15。

5.如权利要求1所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述癌干细胞为神经胶质瘤干细胞。

6.如权利要求1所述树突状细胞疫苗的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述β-葡聚糖的浓度为80～120μg/mL。

7.一种应用如权利要求1～6所述树突状细胞疫苗的制备方法制备的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗是由树突状细胞和黑色素瘤细胞抗原的双基因共表达重组真核载体、β-葡聚糖、皂苷QuilA、胆固醇和卵磷脂组成。

8.如权利要求7所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述双基因共表达重组真核载体为pT-Easy载体。

9.如权利要求7所述的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗由树突状细胞和黑色素瘤细胞抗原的双基因共表达重组真核载体、β-葡聚糖、皂苷QuilA、胆固醇和卵磷脂的质量比为(3～5)：(15～20)：(8～10)：1：1。

10.一种如权利要求7～9任意一项所述的树突状细胞疫苗在制备治疗黑色素瘤疾病的试剂盒中的应用。