[发明专利]一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母及其构建方法

说明书

本发明公开了一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母菌株及其构建方法，所述构建方法包括敲除一个蛋白酶A(PrA)编码等位基因，并对第二个PrA编码等位基因进行序列重组改造；本发明构建的重组菌株显著提高了对有机酸的耐受性能，与原始菌株相比，在pH3.0的YPD培养条件下，柠檬酸对重组菌株生长抑制率降低了33.0％、酒石酸对重组菌株生长抑制率降低了26.0％、苹果酸对重组菌株生长抑制率降低了77.1％；同时，本发明构建的重组菌株在进行厌氧发酵实验中表现出高于原始菌株的乙醇发酵生成能力；本发明为不外加降酸剂和不改变生产工艺的前提下，解决有机酸对发酵的抑制提供了新的思路和方法，对稳定工业生产、降低生产成本和环境保护都具有实际价值和指导意义。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的基因重组，特别是一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母菌株及其构建方法。

技术背景

酵母发酵生产过程中会产生大量的有机酸，使发酵体系的酸度升高，pH值降低。由于酿酒酵母耐酸性能的限制，发酵醪液中酸度的提高会导致酵母的发酵性能降低，影响到生产。对于一些发酵食品(酒类、面包、酱油和食醋等)来说，有机酸也是重要的呈味物质和风味前驱物质，对食品风味品质的提高不可或缺。在酵母发酵生产过程中，由于作为发酵副产物的多种有机酸的不断生成，使发酵醪液的pH值不断下降，酸度不断提高。但酸度的升高会对生产造成危害，包括：①抑制生醇发酵中乙醇的生成，造成减产；②使酵母等有益菌被抑制，生长和发酵活力下降；③使发酵代谢相关酶的活性受到影响，并造成原料的消耗增加，生产效率降低；④产物的产出水平下降，产品得率降低，甚至造成发酵的停滞和提前终止；⑤对于边糖化边发酵的“双边发酵”生产来说，酸度升高时，酵母菌的发酵活力减弱，但糖化作用相对增强，造成醪液中糖分的大量提高，酵母不能及时充分地利用，为杂菌的生长提供了丰富的营养，不利于利用发酵菌株的优势作用来抑制杂菌。杂菌的生长增多，进一步导致酸度的提高，造成糖分和淀粉等物料的浪费。同时会造成发酵产品出现异杂味，产生有毒物质，影响产品的感官品质，甚至影响产品的食用安全性。

通常在生产工艺中采用如下方法来降低发酵体系的酸度：①直接加入碱进行中和，如NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃等。强碱的使用容易破坏缓冲体系，并引起培养基成分发生水解，同时造成发酵液盐度的升高，破坏产品品质或者增加产物的提取难度，降低提取效率；②调整通气量，加速脂肪酸的氧化，减少因脂肪酸的积累而引起的酸度升高。但为保证发酵的进行，此种方法需要同时使用较多种类和数量的消泡剂；③采用直接加入、流加或分批加入等方式补加生理碱性基质，如氨水、尿素等。此种方法除了会增加生产劳动成本和原料成本的投入以外，也会影响产品的品质和风味，同时此种通过化学品添加的方法与方法①一样，都不属于环境友好型生产工艺，会造成一定程度的环境污染和有害排放物的增加。另外，此种方法中所添加的不可避免的过量的氨或铵(NH₃或NH₄⁺)会引起微生物发生中毒，而导致其呼吸强度大幅度下降，甚至造成发酵停滞，还会通过尿素循环途径增加氨基甲酸乙酯的生成，进而影响到产品的食用安全性；④使用多次补料的方式来保持和提高菌株的代谢活力，降低发酵体系的酸度。该方法具有同时能够降低酸度、补充营养和降低产物抑制造成的发酵阻遏的作用，但其对酸度降低的幅度非常有限，对生产的自动化程度要求高，而且较大程度地增加了生产的能耗和人力成本。

基于上述现状，低能耗、低附加原料和人力成本投入、环境友好型的方法才是解决上述发酵生产中实际问题的理想方案。降低发酵体系酸度压力对发酵的抑制作用，既可以在最大程度上保障产品的品质，又能够以最小的经济成本保持发酵的稳定性，同时还有利于建设环境友好型的生产工艺。因此，如何提高生产菌株的酸度耐受性能就成为了解决此类发酵过程中关键问题的一个核心思路。耐酸性酵母由于可以在低pH、高有机酸度条件下生长和发酵，并且可在酸度较高的发酵废液中利用有机物质合成自身蛋白并繁殖，因此还可以用于处理有机发酵废液并生产单细胞蛋白或作为宿主表达外源蛋白，变“废”为“宝”。