[发明专利]一种高有机酸耐受性能的工业生产用酿酒酵母及其构建方法

权利要求书

1.一种高有机酸耐受性能的酿酒酵母菌株在工业生产中的应用，其特征在于，所述酿酒酵母菌株包括以下构建步骤构建：

在对起始酿酒酵母一个编码PrA的等位基因PEP4进行敲除的基础上，对另一个编码PrA的等位基因PEP4的特定部位进行序列改造；所述敲除的等位基因PEP4的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示；所述改造后的等位基因PEP4’的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述的一种高有机酸耐受性能的 酿酒酵母菌株在工业生产中的应用，其特征在于，所述起始酿酒酵母为黄酒酵母。

3.根据权利要求1所述的一种高有机酸耐受性能的酿酒酵母菌株在工业生产中的应用，其特征在于，所述酿酒酵母菌株包括以下构建步骤构建：

(1)以酿酒酵母基因组DNA为模板，通过PCR扩增PrA编码序列PEP4特定的上游区段DNA片段“U-PO”和下游区段DNA片段“D-PO”，并将两个DNA片段进行连接得到DNA片段“PO”；

(2)将DNA片段“PO”连接到载体pMD19后，“PO”序列的上游和下游之间插入DNA片段“Kan”，替换部分原始PrA编码ORF序列得到重组质粒，以重组质粒为模板，通过PCR扩增得到重组DNA片段，以重组DNA片段转化一个蛋白酶A编码序列等位基因敲除的菌株，得到具有一个PrA等位基因PEP4敲除和另一个PrA等位基因编码序列经过改造为PEP4’的重组菌株。

4.根据权利要求3所述的一种高有机酸耐受性能的酿酒酵母菌株在工业生产中的应用，其特征在于，所述酿酒酵母菌株包括以下构建步骤构建：

(1)重组质粒的构建

①以酿酒酵母基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到PEP4基因编码ORF序列上游区段“U-PO”；以酿酒酵母基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到PEP4基因编码ORF序列下游区段“D-PO”；然后将DNA片段“U-PO”和“D-PO”进行连接，得到DNA片段“PO”，并在连接产物中引入2个酶切位点；将DNA片段“PO”克隆到载体pMD19中，得到重组质粒；

②以质粒pUG6为模板，通过PCR扩增得到DNA片段“Kan”，并将得到的DNA片段定向插入到步骤①中得到的质粒的“PO”区段引入的克隆位点，得到重组质粒；

(2)PrA编码序列第二个等位基因的序列改造

①以步骤(1)中构建的重组质粒为模板，通过PCR扩增得到对PrA编码部分ORF序列中间区段使用进行了替换的重组DNA片段“REC-PO”；

②使用电击转化法，以重组DNA片段“REC-PO”转化完成了第一个PrA编码序列等位基因敲除的菌株，得到敲除了一个PrA等位基因的同时另一个PrA等位基因编码序列经过改造的重组菌株。