[发明专利]具有强转运能力和胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株

说明书

本发明涉及具有强转运能力和胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株，通过在简单节杆菌中过表达转运蛋白、或者共表达转运蛋白和热激蛋白来提高菌株的转运能力和胁迫耐受性，获得的上述工程菌株在高浓度底物和有机溶剂的转化体系中仍保持良好的催化活性，C1,2脱氢反应产率较对照菌株提高了1.42％‑51.74％。这种具有强转运能力和胁迫耐受性工程菌株，提高了转化体系中底物和有机溶剂浓度，进而提高了产物生成量，对于甾体类疏水性化合物高浓度底物转化效率的提高具有重要的指导意义。

技术领域：

本发明属于基因工程和微生物转化技术领域，具体涉及到一种具有强转运能力和胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用。

背景技术：

甾体激素类药物是目前临床上用量仅次于抗生素的第二大类药物，具有抗炎症、抗过敏、抗休克、抗变态反应等功效，此外，甾体激素还具有改善蛋白代谢、恢复和增强体力、利尿降压等作用。甾体化合物的C1,2位脱氢反应是工业上采用微生物转化法生产甾体药物的典型代表，也是生产氢化泼尼松及其同系物最有价值的一种反应。简单节杆菌(Arthrobactersimplex)是目前国内工业上常用的甾体C1,2脱氢反应菌株，具有专一性高、反应速率快等优点。如它对醋酸可的松(CA)表现出高活性，生成的产物醋酸泼尼松(PA)的抗炎活性增大了3-4倍。然而，甾体类化合物较差的水溶性(溶解度一般为10^-5-10^-6mol/L)和有限的底物转运能力限制了底物与胞内催化酶的有效接触，进而制约了生产效率。目前为止，添加有机溶剂是工业上甾体生物合成工艺中普遍用来改善底物溶解性的方法。但有机溶剂的用量却因为其对微生物的不利影响受到严格控制，这大大限制了转化体系中底物的投料量，最终影响产率。此外，转化体系中高浓度的底物和产物也会对菌株的活力产生抑制作用，进而影响生产效率。

ABC超家族转运系统存在很多真核和原核生物当中，参与生物的各种生理活动，以主动运输的方式完成多种分子的跨膜转运，而其转运的底物包括糖、氨基酸、多肽、蛋白质、金属离子、药物分子等。MFS超家族转运蛋白是目前已知的最大的膜转运蛋白家族之一。该家族膜转运蛋白广泛存在于整个生物界，其功能也与很多生命活动现象息息相关。作为膜转运蛋白,其基本功能是协助完成物质的跨膜转运，其底物包括单糖、多糖、氨基酸、多肽、维生素、酶辅因子、药物分子、发色团、碱基等众多小分子。

热激蛋白(HSPs)是细胞应对外界压力胁迫的一般应激反应，在正常条件下，HSPs主要负责新生蛋白质的折叠，辅助蛋白质的跨膜运输，组装或拆分寡聚蛋白质结构，并促进不稳定蛋白质的降解以防止蛋白质聚集。在胁迫条件下，它们的作用是防止受损蛋白质的聚集，并帮助其重新折叠。

目前尚无在甾体C1,2脱氢反应菌株中过表达单个转运蛋白、共表达转运和热激蛋白的相关报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种具有强转运能力和胁迫耐受性的简单节杆菌工程菌株的构建方法、菌株及其应用。从而解决现有甾体C1,2脱氢反应菌株底物转运能力低、环境胁迫耐受性差等问题。

本发明实现上述目的的技术方案如下：

本发明的技术方案之一，是提供一株具有强转运能力的简单节杆菌基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌以简单节杆菌(Arthrobacter simplex)CPCC140451为宿主细胞，过表达序列表SEQ ID No.1-7任一所示的基因所得。