[发明专利]示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法

说明书

本发明提供示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法及应用，设计sgRNA，以Cas9质粒为模板，Cas9质粒和sgRNA形成同源重组载体质粒，将同源重组载体质粒经受精卵显微注射后获得F0代小鼠，经测序获得F0代阳性小鼠，F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代杂合子小鼠；将雌性F1代杂合子小鼠和雄性F1代杂合子小鼠自交，获得纯合后代，即为小鼠动物模型。本发明CD3定点插入IRES‑EGFP的人源化动物携带了人类DNA，且携带绿色荧光可示踪肿瘤T淋巴细胞浸润情况，对肿瘤转移的肿瘤微环境变化提供研究模型。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法及应用。

背景技术

原核生物衍生的CRISPR-Cas基因编辑系统改变了操纵，检测，成像和注释不同物种的活细胞中特定DNA和RNA序列的能力。 该技术的易用性和稳健性彻底改变了从基础科学到转化医学的研究的基因组编辑。基于CRISPR/Cas系统的原理，相关人员在体外人工合成了sgRNA序列，以介导Cas蛋白对靶基因的识别和编辑。在sgRNA的指导下，Cas9位于特定的脱氧核糖核酸序列上进行脱氧核糖核酸双链切割，实现基因组的靶向编辑。该基因编辑技术简便、高效、低成本、编辑范围广。

Cd3e 基因CD3是一种T细胞共受体复合体，对TCR信号转导和T细胞分化至关重要。CD3亚基在绝大多数成熟T细胞瘤细胞上表达。T细胞受体基因（例如，CD3D，CD3E，CTLA4和GZMA是驱动许多对癌症免疫力至关重要的基因转录激活的主要因素。

目前利用转基因技术或基因敲除技术进行小鼠的基因修饰，在肿瘤免疫治疗中已得到广泛应用。越来越多的转基因小鼠表达一个或多个完全人类基因或人性化敲入编码正面和负面的免疫调节受体和配体，如PD-L1 CD47, BTLA, CD137, TIM3, LAG-3等等,已经生成并商业化。这些小鼠对免疫-肿瘤检查点组合的评估有重要价值。现有研究表达人源PD-1分子的小鼠已用于表征临床候选抗PD-1抗体。Hu-PBL和Hu-CD34+小鼠模型被描述概括了抗CTLA -4给药后的一些不良自身免疫反应，但仍不能分离免疫相关不良事件和抗癌作用。