[发明专利]示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法

权利要求书

1.一种用于示踪肿瘤T淋巴细胞浸润的CD3e转基因小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述的肿瘤为颅内原位转移瘤，并且所述方法具体包括如下步骤：

(1)sgRNA的设计和寡核苷酸链合成：根据实验需要设计两个sgRNA，所述两个sgRNA的所在位置在CD3e基因的第8个外显子上，与EcoRI酶切后形成的黏性末端互补；其中，所述sgRNA为AGGAAAGGGCTTAGCTATGAGGG和TAGGAAAGGGCTTAGCTATGAGG；

(2)载体构建：以Cas9质粒为模板，Cas9质粒和sgRNA形成同源重组载体质粒；其中，所述同源重组载体质粒包含3.0kb 5’同源臂、IRES-EGFP和3.0kb3’同源臂；

(3)F0代小鼠获得：通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA，将Cas9 mRNA、gRNA和所述同源重组载体质粒经受精卵显微注射后获得F0代小鼠；通过长片段PCR的方式，对F0代小鼠的基因型进行鉴定，PCR结果经测序确认，获得正确同源重组的F0代阳性小鼠；

其中，PCR鉴定采用的引物包括：

5’同源臂所用引物为：

上游引物：CAATCGGGTCTTGTAGCCCTT；和

下游引物：CCTCGGCGGGGTCTTGTAGC；

3’同源臂所用引物为：

上游引物：CCCGCGAGACAAATGAGGTGAAG；和

下游引物：ACAGGCCCCAAGATGCCG；

(4)F1代小鼠获得：F0代阳性小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育获得F1代杂合子小鼠；

(5)将步骤(4)中的雌性F1代杂合子小鼠和雄性F1代杂合子小鼠自交，获得纯合后代，即为小鼠动物模型。

2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在步骤(4)中，还包括对F1代小鼠通过PCR进行基因型鉴定。