[发明专利]RNA病毒核酸检测参照标准品及其用途

说明书

本发明涉及用于RNA病毒核酸检测(RT‑PCR，NGS)的参照标准品，其制备方法和用途，其中所述参照标准品为“模拟病毒颗粒”，其中的慢病毒载体中包含有RNA病毒核酸检测靶向的RNA序列片段、用于示踪的荧光蛋白。

技术领域

本发明属于生物学领域。具体涉及检测RNA病毒(例如冠状病毒，优选SARS病毒，MERS病毒和冠状病毒SARS-CoV-2)中涉及的参照标准品及其用途。

背景技术

冠状病毒感染人体可导致肺炎，如COVID-19等。对冠状病毒的核酸快速检测已成为控制病毒扩散、病人诊断、治疗及预防的重要技术之一。自2019年12月由新型病毒2019-nCoV(2020年2月12日国际病毒分类委员会将新型冠状病毒命名为“SARS-CoV-2”)，感染人体产生新型冠状病毒肺炎流行(世界卫生组织将新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”)，发现2019-nCoV携带者、易感人群、发病率、治病率和死亡率，已成为国内外政府和人们十分关注和敏感的问题。对2019-nCoV的核酸快速检测已成为控制病毒扩散、病人诊断、治疗及预防的重要技术之一。目前国内已有80多家(获得国家批准有7家)企业生产2019-nCoV核酸检测试剂盒，快速推出使用(一般试剂盒的灵敏度都在100～1000拷贝/ml)。但由于缺乏可用于2019-nCoV核酸检测试剂盒及相关设备的与2019-nCoV相似的参照标准品，不能对这些已推出使用的核酸检测试剂盒和相关设备获得检测结果的精确性(阳性和阴性)作出很好的判断，更不能计算待测样本的单位体积病毒颗粒数量(如500病毒颗粒/ml)。因此亟需能准确反映检测准确性及定量2019-nCoV的参照标准品。

RNA病毒(RNA virus)是指其基因组仅由RNA构成的一类病毒，它们的遗传物质是核糖核酸(RNA ribonucleic acid)。RNA病毒有自我复制和逆转录两种复制方式，与DNA病毒相比，RNA病毒更加容易导致疾病、对宿主更加致命、更容易突变，因此种类更多，更难研制有效疫苗，难以预防。与人类疾病相关的、常见的RNA病毒种类很多(表1)，冠状病毒是其中一种。

冠状病毒是线性单链RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒，直径约80-120nm，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。冠状病毒最先于1937年从鸡身上分离出来。1965年，分离出第一株人的冠状病毒。由于在电子显微镜下可观察到其外膜上有明显的棒状粒子突起，使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠，因此命名为“冠状病毒”。

冠状病毒感染人体可导致肺炎，如新型冠状病毒(即SARS-CoV-2)感染的肺炎(COVID-19)等。对SARS-CoV-2的核酸进行快速检测已成为控制病毒扩散、进行精准的疾病诊断、精准治疗及预防的重要技术之一。现有的逆转录PCR核酸扩增检测技术(RT-PCR)、新一代测序技术(NGS)可用于冠状病毒的快速检测。

由于冠状病毒具有高传染性和致病性，不可直接作为其核酸检测的参照标准品。此外，冠状病毒的精准检测也受到多种因素的制约。

在临床采样中，采样时间、采样位置、采样方式、采样管(及其采集温度)的选择，以及样本储存的方法的不同，导致取样误差，无法精确计算待测样本的单位体积中病毒颗粒拷贝数。

实验人员之间的误差，不同实验人员因自身经验和操作习惯上的差异，常常导致结果的差别。

在病毒核酸检测过程中，缺乏与冠状病毒结构相似的参照标准品，不能对现有不同厂家生产的冠状病毒检测试剂盒和相关设备获得检测结果的准确性、特异性和灵敏度(阳性和阴性)作出很好的判断；使用不同厂家或同一厂家不同批次试剂盒的检测结果也存在差异，检测结果对临床诊断和治疗的应用受到限制。

在实验室环境条件方面，不符合国家GMP标准和规范的操作流程的实验室将不可避免地会出现非样本内含物带来的干扰。