[发明专利]一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒，由设在盒体内的偶联有重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)的磁微球、作为阳性对照的RBD中和抗体标准品溶液、阴性对照、样品稀释液、RBD蛋白(HRP-RBD)酶结合物、20×浓缩洗涤液、发光液构成；

其特征在于：

所述磁微球偶联有浓度为5-100μg/mg的重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)；该磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL，稀释液为保存液；

所述RBD中和抗体标准品溶液为：样品稀释液稀释的浓度为1000ng/ml的RBD中和抗体溶液；

所述阴性对照为正常人新冠病毒SARS-CoV-2抗体阴性血清；

所述样品稀释液的配方是：除菌的1000mL纯水中，含NaCl 8g、NaH₂PO₄·2H₂O 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、SDS 1g、酪蛋白钠盐5g、TritonX-100 0.1mL、Proclin300 1mL，pH为7.4；

所述RBD酶结合物是辣根过氧化物酶标记的重组RBD蛋白(HRP-RBD)；HRP标记RBD使用量为其与包被抗原结合恰好饱和的量，该RBD酶结合物使用的效价浓度为1:10000，稀释液为酶结合物稀释液；

所述20×浓缩洗涤液的配方是：除菌的50mL双蒸水中，含NaCl 8.0g、NaH₂PO₄·2H₂O0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、吐温20 0.5mL；

所述发光液包括A液和B液，浓度为3.0mmol/L的鲁米诺溶液与0.3mmol/L对碘苯酚溶液等体积比的混合液命名为A液；浓度为7.5mmol/L的双氧水命名为B液；使用时将A液与B液按体积比1﹕1混合。

2.根据权利要求1所述一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒，其特征在于，所述磁微球的制备方法是：

1.1)配制偶联缓冲液：即配制0.01mol/L的MES缓冲溶液，并调整pH值为6.0；

MES 1.95g

纯化水 定容至1000mL

过滤除菌，4℃保存；

1.2)配制洗涤液，洗涤液的配方及制法是：

过滤除菌，4℃保存；

1.3)配制保存液，保存液的配方及制法是：

过滤除菌，4℃保存；

1.4)偶联操作

(1)羧基磁性微球的活化：取10mg羧基磁性微球，加入500μL的EDC/NHS溶液室温下活化30min，磁分离，偶联缓冲液洗涤磁性微球，得活化后的磁性微球；

其中，所述EDC是：1-乙基-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亚胺盐酸盐，所述NHS是：N-羟基丁二酰亚胺，其溶液使用偶联缓冲液为溶剂配制，其浓度均为2mg/mL，使用前将EDC与NHS溶液等体积比混匀即得到EDC/NHS溶液；

(2)羧基磁性微球与ACE2-hFc偶联：向上述活化后的磁性微球中加入浓度为1-10mg/mL的ACE2-hFc，使磁微球偶联ACE2-hFc的浓度为5-100μg/mg，室温反应3h，磁分离，洗涤液洗涤，即得免疫磁性微球，加保存液于4℃保存，备用；使用时用保存液稀释使磁性微球的工作浓度为0.2-0.5mg/mL。

3.根据权利要求1所述一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒，其特征在于：所述重组人ACE2受体蛋白(ACE2-hFc)是利用CHO细胞表达的人ACE2蛋白与人源化Fc融合的重组蛋白；所述RBD蛋白是利用CHO细胞表达的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长RBD的重组蛋白；所述的RBD中和抗体是用来自于测定的新冠康复患者中和抗体可变区序列并与人源化Fc融合，通过CHO细胞重组表达形成的。