[发明专利]小鼠耳蜗螺旋器的分离和体外培养方法

说明书

本发明涉及小鼠耳蜗螺旋器的分离和体外培养方法。将间隙连接蛋白30、抗氧化剂植酸用于耳蜗螺旋器的体外培养。将植酸与鼠尾胶进行组合使用，制备固定基底膜的胶原凝胶，以及将间隙连接蛋白30作为培养基补料成分，在体外进行小鼠耳蜗螺旋器培养，培养获得的螺旋器毛细胞形态良好、活性佳、存活时间长。本发明采用的分离小鼠耳蜗螺旋器的步骤，简单易行，便于操作。培养中采用免疫染色标记Myo7a方法对耳蜗螺旋器进行染色，染色效果佳，可清晰观察毛细胞的生长状态。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种小鼠耳蜗毛细胞分离和体外培养方法。

背景技术

人类听力功能的基础是存在于颞骨耳蜗内的听觉感受器官，即螺旋器，又称柯蒂氏器、柯替氏器(organ of Corti)。螺旋器内含有特殊的感觉上皮细胞，又称为毛细胞，可以将通过外耳和中耳传入内耳基底膜的声能转化为神经冲动传入大脑。

内耳深嵌在颞骨岩部坚硬的骨质中，不可以直接进行活体观察与照相，也不易将其完整取出而不受周围骨质的影响，这些都给内耳的研究带来许多困难。然而通过体外组织培养法建立起的体外培养内耳的模型系统，则可进行许多受体内条件限制或不能在体内进行的实验研究。此外，由于多数内耳损害（如耳毒性药物、声损伤等）发生于出生后，且内耳组织在胚胎期和出生后个体间有很大差异，故对于发育成熟的内耳器官进行培养并用于内耳疾病研究更具有实际意义。基于内耳自身的解剖特点，螺旋器组织的培养方法在内耳的研究中具有其独特的优越性，是一种理想的耳科实验造模方法。

在进行体外培养试验时，一般采用小鼠作为实验对象，为了获得稳定的实验材料，需要对小鼠包含耳蜗毛细胞的螺旋器进行体外培养，因此快速获得体外培养细胞，并且可以在体外条件下保证螺旋器的生物活性非常重要。但小鼠耳蜗较小，进行细胞分离及培养难度较大，因此提供一种分离简单，培养成功率高，细胞存活率高的方法非常必要。

耳蜗螺旋器附着在基底膜上，两者难以分离，体外组织培养也不将两者分离，耳蜗螺旋器的体外培养即为包含耳蜗螺旋器的基底膜的培养。现有的耳蜗螺旋器体外培养方法包含立体培养法，其相对贴壁培养法更接近体内环境。然而现有的立体培养法仍存在诸多不足之处，其培养获得的耳蜗螺旋器细胞存在形态不佳、活性较差、存活时间短等问题。传统的培养方法离体培养的耳蜗螺旋器，其内耳毛细胞形态维持时间仅为3-5天，且随着培养时间的延长毛细胞数量逐渐降低、毛细胞纤毛束的形态逐渐消失。因此，本领域存在改进耳蜗螺旋器立体培养法的需求。

对现有技术检索发现，间隙连接蛋白30（CX30，又称间隙连接蛋白beta-6，序列信息见UniProtKB-095452）大量表达于耳蜗侧壁及螺旋器，人类螺旋神经节细胞（SG）同样表达CX30，CX30在人类螺旋器支持细胞中高表达（参见：张红蕾等，人类耳蜗连接蛋白的特定表达，公开日期20151231）。但现有技术仅公开了该基因的在螺旋器中的表达情况，并没有公开或暗示CX30基因表达的间隙连接蛋白30可用于螺旋器的体外培养。本发明通过实验发现，将间隙连接蛋白30作为培养基补料成分，在体外培养小鼠耳蜗螺旋器时使用，对细胞存活时间具有延长作用。

此外，现有技术表明（参见：王爱梅等，α-硫辛酸对卡那霉素致离体小鼠耳蜗毛细胞损伤的防护作用，公开日期2013），抗氧化剂α-硫辛酸对离体小鼠耳蜗毛细胞损伤具有防护作用。本发明进一步对其他功能类似的抗氧化剂进行筛选，发现抗氧化剂植酸（肌醇六磷酸）对小鼠耳蜗螺旋器的体外培养同样具有益处。将植酸与鼠尾胶进行组合使用，制备胶原凝胶，将包含螺旋器的耳蜗基底膜固定在其中，进行体外培养，培养获得的细胞形态良好、活性佳、存活时间长。

发明内容

针对如上所述现有技术中耳蜗螺旋器体外分离及培养方法的不足，本发明的目的是提供一种新生小鼠耳蜗螺旋器的分离和体外培养方法，可有效地分离得到完整的包含螺旋器的耳蜗基底膜，通过在培养过程中使用间隙连接蛋白30和植酸，培养获得的细胞形态良好、活性佳、存活时间长。

本发明的一方面提供一种小鼠耳蜗螺旋器的分离和体外培养方法，其特征在于，包含如下步骤：