[发明专利]小鼠耳蜗螺旋器的分离和体外培养方法

权利要求书

1.一种小鼠耳蜗螺旋器的分离和体外培养方法，其特征在于，包含如下步骤：

(1)将断头后的小鼠剪开头部皮肤，用手术刀片沿颅骨矢状线将头部切开，转移至装有无菌PBS的培养皿中，去除脑组织；

(2)用精细镊剔除耳蜗与颞骨的链接，切断耳蜗与前庭组织的连接，将耳蜗取出，并转移至装有DMEM/F12培养液的培养皿中；

(3)从耳蜗底转向顶转剥离骨迷路，得到绕蜗轴的螺旋韧带和螺旋器，用精细镊夹住螺旋韧带和螺旋器的底部，将其从蜗轴上解旋下来，从底部将螺旋韧带和包含耳蜗螺旋器的基底膜分离，获得包含耳蜗螺旋器的基底膜；

(4)耳蜗螺旋器的培养：取适量胶原凝胶滴到培养皿中央，将所述基底膜浸入胶原凝胶，将培养皿移入CO₂培养箱温育20-30分钟后取出，见胶原凝胶凝固成胶块，基底膜被固定在其中，向培养皿中加入适量无血清培养液以淹没胶块为度，最后放回CO₂培养箱中培养，培养液隔日更换为补料培养基，培养7-10天，其中所述胶原凝胶包含鼠尾胶和终浓度为50mM的植酸，所述补料培养基在所述无血清培养液的基础上添加终浓度为20mM的间隙连接蛋白30。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶原凝胶通过如下方法制备：鼠尾胶、10×BME以及2% Na₂CO₃比例为9：1:1，添加终浓度50mM的植酸，混合均匀，置于冰上，防止凝固。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述无血清培养液的各组分体积百分百为，1×DMEM 96.4%，20%葡萄糖 2.4%，青霉素G 0.2%，谷氨酰胺 1%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小鼠是出生后3-5天的C57BL/6J小鼠。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中DMEM/F12培养液还进一步包含体积百分比为1%的N2补料，体积百分比为2%的B27补料，以及终浓度为50μg/ml的氨苄青霉素；步骤（3）在解剖显微镜下进行。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）耳蜗螺旋器的培养天数是10天。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中CO₂培养箱的培养条件是37℃、5% CO₂。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中所述温育时间是20分钟。

9.根据权利要求1-2、4-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在耳蜗螺旋器的培养阶段，采用免疫染色标记Myo7a方法观察耳蜗基底膜螺旋器组织以及毛细胞活性。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述免疫染色标记Myo7a方法包括：

1）将培养的耳蜗螺旋器移除培养液，加入2ml 4% 的福尔马林固定液，室温放置15分钟后用PBS洗去；

2）加入2ml 0.1%的PBS配制的Triton x-100溶液，室温放置15分钟后用PBS洗去；

3）加入2ml 2.5%的PBS配制的BSA溶液，室温放置30分钟后用PBS洗去；

4）一抗孵育，其为Rabbit anti-Myo7a 1:200，2.5% BSA于PBS中，4°C过夜；

5）用PBS洗去一抗，加入二抗，其为Alexa Fluor 546 goat-anti Rabbit IgG 1:1000,2.5% BSA于PBS中，室温放置2小时；

6）用PBS洗去二抗，后用荧光显微镜进行观察、拍照。