[发明专利]一种氨氧化细菌的接合转移方法

说明书

本发明公开了一种氨氧化细菌的接合转移方法，属于生物工程技术领域。包括：(1)供体菌富集培养、(2)氨氧化细菌富集培养和(3)氨氧化细菌接合转移步骤，可以将目的质粒有效转入氨氧化细菌，转化率高达0.001％，为自养型氨氧化细菌的接合转移打下基础。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种氨氧化细菌的接合转移方法。

背景技术

耐药基因作为新型环境污染物，已有的研究表明，耐药基因进入污水生物处理系统后，对生物污水处理效率尤其是脱氮效率产生影响。亚硝化反应是污水系统生物脱氮的关键反应，是由氨氧化菌(AOB)完成的，这个过程包括氨单加氧酶(ammoniamonooxygenase,AMO)催化氨成为羟胺，以及羟胺由羟胺氧化酶(Hydroxylamineoxidoreductase,HAO)催化生成亚硝酸盐。氨氧化菌是革兰氏阴性菌，归属于Proteobacteria门的β-Proteobacteria纲或γ-Proteobacte ria纲，被认为是污水生物处理系统中最为敏感、脆弱的代谢途径，是系统稳定运行的关键环节。目前仍未见到构建载带有耐药质粒的氨氧化菌的方法，本方法提供了一种氨氧化细菌ATCC19718的接合转移方法，可用于构建载带有耐药质粒的氨氧化菌模型，用于研究耐药基因对氨氧化过程的影响及机制。

目前主要建立的接合转移方法主要针对异养菌如E.coli，氨氧化细菌是一种化能自养菌，目前尚没有见到关于氨氧化细菌接合转移方法的相关报道。

因此，如何提供一种氨氧化细菌接合转移方法是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明公开了一种氨氧化细菌的接合转移方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种氨氧化细菌的接合转移方法，步骤包括：

(1)供体菌富集培养

将目的质粒导入供体菌中，得目的供体菌，而后将供体菌富集培养，得活化目的供体菌；

(2)氨氧化细菌富集培养

将氨氧化细菌富集培养，得活化氨氧化细菌；

(3)氨氧化细菌接合转移

将活化目的供体菌和活化氨氧化细菌混合并加入缓冲液，调至活化目的供体细菌终浓度为2×10⁸cfu/ml，活化氨氧化细菌终浓度为10⁸cfu/ml；培养4h以上，得接合转移菌液；

优选的，供体菌为大肠杆菌；

更优选的，供体菌为HB101；

优选的，目的质粒为RP4；

优选的，氨氧化细菌为ATCC19718；

步骤(1)中，活化目的供体菌的浓度为10⁹cfu/mL；

优选的，所述供体菌富集培养基为LB培养基；

优选的，所述供体菌富集培养时间为8h；

步骤(2)中，活化氨氧化细菌的浓度为10⁹cfu/mL；

优选的，所述氨氧化细菌富集培养基成分包括：0.25g/L硫酸铵、1.0g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、2.0g/L氯化钠、0.4g/L七水合硫酸亚铁和5.0g/L碳酸钙，溶液为水；

步骤(3)中，所述缓冲液成分包括：0.5g/L硫酸铵、2.0g/L磷酸氢二钾、1.5g/L七水硫酸镁、20g/L胰化蛋白胨、10g/L酵母提取物，1.0g/L七水合硫酸亚铁和10.0g/L氯化钠，溶液为水；