[发明专利]一种培养犬瘟热病毒和犬细小病毒的方法及应用

说明书

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种培养犬瘟热病毒和犬细小病毒的方法。所述方法包括以Vero细胞作为犬瘟热病毒的宿主，以F81细胞作为犬细小病毒的宿主，通过生物反应器进行培养；所述生物反应器中载体为片状载体。本发明通过生物反应器进行犬瘟热病毒和犬细小病毒的培养，以Vero细胞作为犬瘟热病毒的宿主，以F81细胞作为犬细小病毒的宿主在片状载体上进行培养，生产得到的犬瘟热病毒和犬细小病毒滴度高，批间差异小，产品质量稳定。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一种培养犬瘟热病毒和犬细小病毒的方法及应用。

背景技术

狗是人类重要的伴侣动物之一，宠物产业市场目前正呈现快速发展的势头，城市宠物狗的数量也相应地增多。因此，加强对犬主要疾病的防控是当务之急，疫苗免疫被认为是犬病防控的最直接有效的措施。

犬瘟热病毒(CDV)病和犬细小病毒(CPV)病是当前对养犬业危害严重的两种病毒性传染病。经常引起大批犬、貂和狐等动物发病，经济损失惨重。CDV可以感染包括大熊猫、小熊猫以及狮、虎和豹等食肉目所有8个科、偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，发病率可达100％，病死率达80％。CPV可引起犬出血性肠炎与心肌炎。此外，CPV还可引起虎、狮、果子狸和猴等野生动物的感染。

目前，培养犬瘟热和犬细小病毒制备疫苗的方法多采用传统的转瓶生产工艺。传统生产工艺与当前大规模动物疫苗生产不相适应，主要表现在(1)转瓶细胞培养，不能做到培养条件适时调整，无法保证细胞处于最佳状态，培养细胞密度小，生产病毒滴度低；(2)转瓶细胞培养，细胞批间差异大，产品质量不均一、不稳定；(3)转瓶细胞培养操作流程复杂，污染风险大；(4)转瓶细胞培养，生产效率低，费时费力。面对当前市场形势，需要一种可以大规模培养高病毒滴度犬瘟热和犬细小病毒的方法。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种培养犬瘟热病毒和犬细小病毒的方法及应用，通过生物反应器以片状载体进行两种病毒的培养，生产病毒滴度高，产品质量稳定。

第一方面，本发明提供一种培养犬瘟热病毒和犬细小病毒的方法，包括：

以Vero细胞作为犬瘟热病毒的宿主，以F81细胞作为犬细小病毒的宿主，通过生物反应器进行培养；

所述生物反应器中载体为片状载体。

目前，通过生物反应器培养Vero细胞和F81细胞这类贴壁细胞常采用微载体和片状载体。微载体指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长的微珠。片状载体采用适合于细胞贴壁、生长的聚酯纤维，经过超声波处理、加工而成，为细胞生长提供足够的表面空间。本发明在实验中采用发现采用微载体时，当细胞和病毒同时接种后，细胞无法持续附着在微载体表面生长，而本发明通过进一步实验摸索采用片状载体可以使得接种了犬瘟热病毒和犬细小病毒的Vero细胞和F81细胞正常生长，并且生长状态良好，生产病毒滴度较高。

进一步地，所述片状载体为聚酯纤维片状载体。

进一步地，所述生物反应器为固定床篮式搅拌桨反应器。

进一步地，所述Vero细胞在进行培养前的接种密度为4-5×10⁵cell/mL；所述F81细胞在进行培养前的接种密度为3-4×10⁵cell/mL。

进一步地，所述Vero细胞和所述F81细胞在培养时用的培养基均为包含1.8％～2.2％新生牛血清的199培养基，pH为7.0～7.2。

本发明所使用的培养基为199低血清培养基(可市售购得)，F81细胞和Vero细胞在该培养基2％血清含量就可以和其他培养基(例如DMEM)10％血清含量下取的类似的培养效果。

进一步地，所述Vero细胞的培养条件为：