[发明专利]胞外段为Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子及表达该分子的CAR-T细胞及其用途

说明书

本发明公开了一种胞外段为Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子及表达该分子的CAR‑T细胞及其用途，属于体外基因修饰的淋巴细胞过继免疫治疗技术领域。提供的CAR‑T细胞可表达胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子，能够广谱性识别并结合多种实体肿瘤细胞表面肿瘤相关抗原并有效浸润到实体肿瘤微环境中的肿瘤组织，实现高效杀伤实体肿瘤细胞的目的，为实体肿瘤的CAR‑T细胞过继性免疫治疗提供了新的方法和策略。

技术领域

本发明属于体外基因修饰的淋巴细胞过继免疫治疗技术领域，具体涉及一种胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9分子的CAR分子及表达该CAR分子的基因工程改造的CAR-T细胞及其用途，尤其涉及一种胞外段为肿瘤结合特异性单链Vδ2(OT3)Vγ9分子的CAR分子及表达该CAR分子，并以自分泌形式表达IL-7和CCL19的基因工程改造的CAR-T细胞，以及该CAR-T细胞和该CAR分子的抑癌用途。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的重大难治性疾病，尤其是近十几年来，肿瘤的发病率和死亡率在全世界范围内都持续上升。针对肿瘤的治疗方法，除了传统的手术疗法、放射疗法和化学疗法外，免疫疗法也正在成为一种新的策略，尤其是其中之一的采用嵌合抗原受体(CAR)分子的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法。

CAR分子最初是由Zelig Eshhar教授团队的Gideon Gross博士等报道，是一种人工构建的融合基因编码的跨膜分子，主要由三部分组成—胞外段、跨膜段和胞内段，胞外段主要负责特异性的肿瘤抗原的识别，胞内段负责信号的转导，会刺激T细胞的增殖，并且通过细胞溶解和细胞因子释放来消除肿瘤细胞，跨膜段则用来连接胞外段和胞内段。其中CAR分子的胞外段主要是由识别肿瘤相关抗原的特异性单链抗体可变区组成，其在CAR-T细胞治疗中起到“精确导航”的作用，能够准确识别肿瘤细胞表面暴露的肿瘤相关抗原，然后激活CAR-T细胞，对肿瘤细胞进行靶向“定点清除”，并可以避免对正常组织和细胞的伤害，使得CAR-T细胞治疗具有高效精准杀伤肿瘤细胞的优势，另外还具有免疫记忆功能以及能够长期在体内存活等优势。

目前，CAR-T细胞疗法已经在血液恶性肿瘤中取得了很好的临床效果，例如CAR分子的胞外段以CD19为靶点在治疗急慢性白血病中的应用，然而其在实体肿瘤中的应用却遭遇挑战。实体肿瘤位于局部组织中，而且形成了复杂的免疫抑制性微环境，成为CAR-T细胞有效浸润至肿瘤细胞的屏障，并在肿瘤微环境中难以维持其功能，使其针对实体肿瘤难以发挥杀伤效力；此外实体肿瘤的肿瘤相关抗原相较于血液恶性肿瘤具有高度异质性，即其肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原差异巨大，导致在设计CAR分子时肿瘤特异性靶点难以确定，这些已经成为CAR-T细胞疗法在实体肿瘤的应用上的瓶颈。因此，设计一种能够有效靶向实体肿瘤表面的肿瘤相关抗原的CAR分子及具有良好的肿瘤组织浸润性的CAR-T细胞对于CAR-T细胞疗法在实体肿瘤治疗的应用中具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种表达胞外段为Vδ2(OT3)Vγ9的CAR分子的CAR-T细胞，命名为Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞，所述CAR分子包括胞外段、跨膜段和胞内段；其中所述胞外段位于αβT细胞外，包含γδTCR的γ9链可变区(简称Vγ9)和与Vγ9连接的CDR3区被OT3多肽置换的δ2链的可变区(简称Vδ2(OT3))，所述跨膜段贯穿αβT细胞的细胞膜，用于连接胞外段中的Vγ9和胞内段，所述胞内段位于αβT细胞内。

上述跨膜段为CD8a分子，所述胞内段包含CD28、CD137及CD3分子的zeta链(CD3z)。

上述的Vδ2(OT3)Vγ9 CAR-αβT细胞还以自分泌形式同时表达细胞因子IL-7和/或趋化因子CCL19。

本发明另一方面提供一种CAR分子，其包括胞外段、胞内段和连接两者的跨膜段，其中所述胞外段包含与跨膜段相连的γδTCR的γ9链可变区(Vγ9)，和与Vγ9连接的CDR3区被OT3多肽置换的δ2链的可变区(Vδ2(OT3))。