[发明专利]基于4-硫代核苷氧化胺解反应和测序技术的核酸代谢标记检测方法

权利要求书

1.一种5-R₁-4SdU代谢标记核酸的测定方法，其特征在于，所述方法包括：

1）利用5-R₁-4SdU对生物样品中的核酸进行标记，获得标记后的生物样品，其中，所述标记后的生物样品中包含含有5-R₁-4SdU的核酸；

2）提取所述标记后的生物样品中的核酸，以便获得第一核酸提取物；

3）将所述第一核酸提取物中的第一部分进行如制备核酸转化产物的方法中的氧化反应和胺解反应，以便获得反应后的核酸，其中，进行所述胺解反应后，所述含有5-R₁-4SdU的核酸中的5-R₁-4SdU转化为5-R₁-N4-R₂-dC；

4）将所述第一核酸提取物中的第二部分与3）中所述反应后的核酸分别进行扩增或文库构建，并进行测序，比较所述第一核酸提取物中的第二部分与所述反应后的核酸的测序结果，其中，核酸中出现T-C突变聚集的区域为该区域出现复制和/或修复的指示；

其中，R₁选自氢、C₁-C₄的烷基；

R₂选自氢、C₁-C₈的烷基、C₅-C₂₀的芳香基、胺基、羟基；

其中，所述制备核酸转化产物的方法包括：

（1）以包含含有5-R₁-4SdU的核酸为反应底物，在氧化剂作用下进行氧化反应，以便获得氧化中间产物，所述氧化中间产物结构式为：

；

（2）以所述氧化中间产物为反应底物，在胺类化合物R₂-NH₂作用下发生胺解反应，以便获得所述核酸转化产物；

其中，所述胺类化合物R₂-NH₂选自氨、脂肪胺、芳香胺、肼、羟胺，

所述氧化剂选自间氯过氧苯甲酸、KMnO₄、OsO₄、H₂O₂、NaIO₄、NaIO₃，

所述氧化剂的浓度为10 μM-200 mM，

所述胺类化合物R₂-NH₂的浓度为1mM-5 M。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品选自细胞、组织、细菌、真菌、病毒。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物样品为细胞，利用5-R₁-4SdU对所述细胞中的核酸进行标记时，培养所述细胞的培养基中加入的5-R₁-4SdU浓度为1 μM-100mM。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸为DNA，进行扩增时所用的DNA聚合酶选自Taq、Q5、Phusion。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有5-R₁-4SdU的核酸通过体外合成方式获取或源自经5-R1-4SdU代谢标记的生物对象的核酸。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有5-R₁-4SdU的核酸为体外合成的核酸，其浓度为0.025 μM-125 μM。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有5-R₁-4SdU的核酸为经5-R1-4SdU代谢标记的生物对象的核酸，其浓度0.025 ng/μL-12.5 μg/μL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述氧化反应或胺解反应的反应体系pH为5.0-13.0。