[发明专利]一种新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种新冠病毒S1‑RBD蛋白羊驼纳米抗体及其制备方法和应用。本发明的新冠病毒S1‑RBD蛋白羊驼纳米抗体的制备方法，包括：A)从免疫羊驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA，并反转录扩增cDNA；B)以cDNA为模板扩增羊驼抗体VHH基因，将其与载体连接构建噬菌体文库；C)从噬菌体文库中筛选阳性克隆；D)利用阳性克隆构建羊驼纳米抗体表达载体，经诱导表达和纯化，获得新冠病毒S1‑RBD蛋白羊驼纳米抗体。本发明的新冠病毒S1‑RBD蛋白羊驼纳米抗体不仅能够大大提高检测诊断的特异性和准确性，并且具有中和新冠病毒的中和活性，在作为新冠病毒肺炎治疗的纳米抗体药物上具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，尤其是涉及一种新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体及其制备方法和应用。

背景技术

羊驼的免疫系统在检测到细菌和病毒等外来入侵者时会产生两种类型的抗体：一种类似于人抗体IgG，另一种只有四分之一大小，这些较小的抗体称为单域抗体或纳米抗体(即缺失轻链的“重链抗体”)，这种缺失轻链的重链抗体只有很小的片段也能和正常的IgG等抗体一样去结合抗原，直接利用大肠杆菌培养噬菌体就可以获得大量的纳米抗体。

新型冠状病毒蛋白分为刺突糖蛋白(S蛋白，spike protein)、包膜糖蛋白(E蛋白)、膜糖蛋白(M蛋白)和核衣壳蛋白(N蛋白)。在冠状病毒中起关键作用的S蛋白包含2个亚单位，即S1和S2。S1蛋白能够促进病毒与宿主细胞受体的结合，其含有一个重要的C端RBD结构域，正是这个区域负责和受体结合。

目前，市场上的新冠检测试剂盒只有新冠病毒核酸检测试剂盒和新冠病毒抗体检测试剂盒两大类，既没有应用于该领域的新冠病毒羊驼抗体，也没有应用新冠病毒羊驼抗体检测新冠病毒蛋白的检测试剂盒，更没有极具临床应用价值、可开发为治疗新冠病毒肺炎临床药物的具有中和病毒能力的羊驼纳米抗体。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体及其制备方法和应用，该新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体在用于新冠病毒检测时大大提高了检测诊断的特异性和准确性，同时该抗体还具有中和新冠病毒的中和活性，在作为新冠病毒肺炎治疗的纳米抗体药物上具有良好的应用前景。

本发明提供一种新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体的制备方法，包括：

A)从免疫羊驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA，并反转录扩增cDNA；

B)以cDNA为模板扩增羊驼抗体VHH基因，将其与载体连接构建噬菌体文库；

C)从噬菌体文库中筛选阳性克隆；

D)利用阳性克隆构建羊驼纳米抗体表达载体，经诱导表达和纯化，获得新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体。

在本发明中，所述免疫羊驼是经重组新冠病毒S1蛋白免疫的羊驼；具体地，免疫时重组新冠病毒S1蛋白的剂量可以为0.4mg/只；每隔2周进行一次免疫，在第6次免疫2周后获得免疫羊驼。

在本发明中，反转录扩增cDNA包括：

向RNase free离心管中加入5×gDNA digester Mix 6μL和总RNA 2μg，加RNasefree超纯水至总体积为30μL，混匀，于42℃孵育2分钟，得到反应液；

向所述反应液中加入ⅢSuperMix plus 10μL，混匀后进行反转录，反转录程序为：25℃5分钟，55℃15分钟，85℃5分钟。

在本发明中，采用巢式PCR扩增羊驼抗体VHH基因，包括：