[发明专利]一种新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体的制备方法，其特征在于，包括：

A)从免疫羊驼的外周血淋巴细胞中提取总RNA，并反转录扩增cDNA；

B)以cDNA为模板扩增羊驼抗体VHH基因，将其与载体连接构建噬菌体文库；

C)从噬菌体文库中筛选阳性克隆；

D)利用阳性克隆构建羊驼纳米抗体表达载体，经诱导表达和纯化，获得新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体；

优选地，免疫羊驼是经重组新冠病毒S1-RBD蛋白免疫的羊驼。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，免疫时重组新冠病毒S1-RBD蛋白的剂量为0.2-0.8mg/只，优选为0.4mg/只；

优选地，每隔2周进行一次免疫，在第6次免疫2周后获得免疫羊驼。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，反转录扩增cDNA包括：

向RNase free离心管中加入5×gDNA digester Mix 6μL和总RNA 2μg，加RNase free超纯水至总体积为30μL，混匀，于42℃孵育2分钟，得到反应液；

向所述反应液中加入4×Ⅲ SuperMix plus10μL，混匀后进行反转录，反转录程序为：25℃ 5分钟，55℃ 15分钟，85℃ 5分钟。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用巢式PCR扩增羊驼抗体VHH基因，包括：

以cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，得到第一轮扩增产物；第一轮PCR扩增体系为：2×phanta mix 25μL，Primer F 0.5μL，Primer R 0.5μL，模板cDNA 2μL，ddH₂O至总体积50μL；第一轮PCR扩增程序为：96℃ 5min，95℃ 20s，65℃ 20s，72℃ 20s，72℃ 5min，25℃ ∞，32个循环；

利用第一轮扩增产物进行第二轮PCR扩增，得到第二轮扩增产物；第二轮PCR扩增体系为：2×phanta mix 25μL，Primer F 0.5μL，Primer R 0.5μL，第一轮扩增产物50ng，ddH₂O至总体积50μL；第一轮PCR扩增程序为：96℃ 5min，95℃ 20s，58℃ 20s，72℃ 20s，72℃5min，25℃ ∞，32个循环。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，构建噬菌体文库包括：

采用Sfi I对第二轮PCR扩增产物和载体pHEN1进行酶切，酶切后回收载体和羊驼抗体VHH基因并进行连接反应，得到连接产物；

将连接产物转化至TG-1感受态细胞中，培养至OD600达到0.6-0.8，优选为达到0.7后，加入辅助噬菌体继续培养，收细菌培养上清，获得噬菌体文库。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用包被有重组新冠病毒S1-RBD蛋白的酶联板对噬菌体文库进行筛选，得到阳性克隆。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括：

对噬菌体文库进行放大培养、分离、亲和筛选、鉴定、测序，得到羊驼抗体VHH基因序列。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将阳性克隆中富集度较高的序列亚克隆到pET22b载体上，获得羊驼纳米抗体表达载体。

9.一种新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体，其特征在于，按照权利要求1-8任一所述的制备方法制得。

10.权利要求9所述的新冠病毒S1-RBD蛋白羊驼纳米抗体在检测新冠病毒蛋白或作为新冠病毒抗体药物的应用。