[发明专利]人-人嵌合型抗病毒IgG抗体阳性质控品的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种人‑人嵌合型抗病毒IgG抗体阳性质控品的制备方法及其应用。本制备方法主要包括以下步骤：收集、分离阳性患者外周血单个核细胞的总RNA提取及逆转录获得cDNA；PCR扩增获得目的片段scFv并构建噬菌体抗体文库；噬菌体抗体文库的筛选及特异性单克隆抗体的获得；scFv的VH和VL分别与人的IgG1恒定区和Cκ恒定区拼接，最终获得具有良好特异性、高亲和力和稳定性的人‑人嵌合型抗病毒IgG抗体阳性质控品。本发明具有适用于多种检测试剂盒，对病毒感染者的临床诊断具有重要使用价值。

技术领域

本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及人-人嵌合型抗病毒IgG抗体阳性质控品的制备方法及其应用。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)感染主要是通过酶联免疫法和化学发光免疫法两种针对HCV抗体的血清学检测方法来提高丙肝患者的早期发现率。为了在实验过程中准确的监控试剂、样品和实验者操作等因素对实验结果造成的影响，阳性对照必不可少。传统的阳性对照主要来自丙肝患者的阳性血清，由于此阳性质控品在应用上还存在明显缺陷，如较难获得且成本高、涉及到论理学问题、稳定性不好、在应用上潜在的生物传染性，最重要的是，即使是同一试剂盒之间也会出现阳性对照品批间差异大的问题。因此人们尝试开发新的途径找到这些质控品的替代品，有文献报道，使用化学交联的方法将单克隆抗体与人IgG的Fc段连接在一起用于抗细胞核抗原SS-B/La IgG抗体检测的质控品，还有人通过基因工程的方法，表达出人源特异性分子片段以作为ELISA检测质控品。

尽管通过DNA重组的方法能够解决传统质控品来源少，潜在生物传染性方面的弊端，但在实验操作方面涉及到杂交瘤技术、重组DNA技术等，较为复杂，延长了质控物的制备周期，并且最重要的是嵌合型单克隆抗体是通过其他物种源性的可变区与人源性的恒定区进行不同方法的嵌合而形成，故此单克隆抗体嵌合体与真实的人血清标本特异性抗体相比，在很多方面有所不及。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种人-人嵌合型抗病毒IgG抗体阳性质控品的制备方法及其应用。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：

人-人嵌合型抗病毒IgG抗体阳性质控品的制备方法，包括以下步骤：

(1)、收集、分离阳性患者外周血单个核细胞的总RNA提取及逆转录获得cDNA；

(2)、PCR扩增获得目的片段scFv并构建噬菌体抗体文库；

(3)、噬菌体抗体文库的筛选及获得特异性单克隆抗体；

(4)、scFv的VH和VL分别与人的IgG1恒定区和Cκ恒定区拼接，以获得人-人嵌合型抗病毒IgG抗体阳性质控品。

优选的，所述目标病毒包括流感病毒、梅毒、HIV、HPV、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。

优选的，所述目标病毒为丙型肝炎病毒。

优选的，本发明还提供一种人-人嵌合型抗丙肝IgG抗体阳性质控品的构建方法，在本发明中包括四个主要步骤，所述第一步为收集、分离的丙肝阳性患者外周血单个核细胞总RNA的提取及逆转录获得cDNA；所述第二步为PCR扩增获得目的片段scFv并构建噬菌体抗体文库；所述第三步为噬菌体抗体文库的筛选获得特异性抗丙肝单克隆抗体；所述第四步为scFv的VH和VL分别与人的IgG1恒定区和Cκ恒定区拼接，最终获得具有良好特异性、高亲和力和稳定性的5个人-人嵌合型抗丙肝IgG抗体阳性质控品。

本发明第一方面，所述收集、分离的丙肝阳性患者外周血单个核细胞总RNA的提取及逆转录获得cDNA，具体步骤为：(1)、收集20-30管(2-3mL/管)丙肝阳性患者外周血，用聚乙烯比咯烷酮硅胶(Percoll)分离法分离外周血单个核细胞(PBMC)；(2)、分离后的单个核细胞沉淀用于总RNA提取，-80℃保存备用；(3)、将提取的总RNA进行逆转录获得cDNA。