[发明专利]人-人嵌合型抗病毒IgG抗体阳性质控品的制备方法及其应用

权利要求书

1.人-人嵌合型抗病毒IgG抗体阳性质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、收集、分离阳性患者外周血单个核细胞的总RNA提取及逆转录获得cDNA；

(2)、PCR扩增获得目的片段scFv并构建噬菌体抗体文库；

(3)、噬菌体抗体文库的筛选及获得特异性单克隆抗体；

(4)、scFv的VH和VL分别与人的IgG1恒定区和Cκ恒定区拼接，以获得人-人嵌合型抗病毒IgG抗体阳性质控品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述目标病毒包括流感病毒、梅毒、HIV、HPV、乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述目标病毒为丙型肝炎病毒。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括如下步骤：

a、收集20-30管(2-3mL/管)丙肝阳性患者外周血，用聚乙烯比咯烷酮硅胶分离法分离外周血单个核细胞；

b、分离后的单个核细胞沉淀用于总RNA提取；

c、将提取的总RNA进行逆转录获得cDNA。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括如下步骤：

a、使用ImMunoGene Tics数据库设计引物；

b、PCR扩增获得抗体的轻链可变区片段V_L和重链可变区V_H，所述轻链可变区片段V_L包含V_κ和V_λ；

c、通过重叠PCR，将V_H和V_L以linker为衔接组装为scFv；

d、PCR的产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化；

e、scFv片段被克隆到pCANTAB 5E上，电转化TG1感受态细胞，涂布SOB-AG平板；

f、SOB-AG平板计数单菌落，挑取单克隆进行酶切鉴定，计算噬菌体抗体文库库容。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体包括如下步骤：

a、用丙肝抗原过夜包被免疫管，并设定阳性对照和阴性对照，然后用脱脂奶粉封闭；

b、弃封闭液，用PBST洗涤，将重组噬菌体培养上清液加入免疫管中，在37℃摇床中孵育后室温静置；

c、弃上清，用PBST洗涤，加入Glycine-HCl轻柔转动洗脱后立即加入等体积的Tris-His缓冲液中和洗脱液，再加入宿主菌TG1后并震荡培养，完成一轮淘筛，然后用同样方法继续进行淘筛；

d、淘筛完成后，分别获得针对丙肝不同抗原的四个噬菌体抗体库，从淘筛后的4个噬菌体抗体库中各选择20个，总计80个菌落通过ELISA对其进行筛选；

e、用96孔板分别过夜包被丙肝核心、NS3、NS4、NS5抗原；

f、从淘筛后的4个噬菌体抗体库中各选择50个单克隆菌落，总计200个分别加入到含2×YT液体培养基的免疫管中，震荡培养；

g、弃掉步骤e中96孔板里的上清，用PBST洗涤，将步骤f中培养上清加入到96孔中，37℃孵育；

h、弃上清，用PBST洗涤，加入HRP-antiM13抗体，所述HRP-anti M13抗体由脱脂奶粉稀释液稀释，然后置于室温孵育；

i、弃上清，PBST洗涤，加入TMB显色液显色，终止液终止显色后测定各孔吸光度值；j、最终选取特异性最高的丙肝NS3、NS4、NS5和两个丙肝核心scFv抗体进行测序，获得五个高特异性抗丙肝单克隆抗体基因序列。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)具体包括如下步骤：

a、通过PCR将抗体的V_H和V_L分别与含有人IgG1恒定区序列的pcdna3.4.1载体和含有人Cκ恒定区序列的pcdna3.4.2载体进行拼接；

b、对步骤a中质粒分别共转染，转染72-96小时后，收集细胞上清，离心除去细胞碎片后纯化单克隆抗体，获得人-人嵌合型抗丙肝IgG抗体。