[发明专利]一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统构建的质粒载体和应用

说明书

本发明公开了一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统构建的质粒载体和应用。该系统包括：阻遏蛋白CymR基因、启动子、操纵基因CuO及强启动子；启动子控制阻遏蛋白CymR基因，强启动子控制操纵基因CuO。所述阻遏蛋白CymR基因的序列如SEQ ID NO:1所示；所述操纵基因CuO的如SEQ ID NO:2所示。本发明提供的质粒载体包含上述cumate诱导系统。本发明构建的诱导系统严格受诱导剂cumate(四‑异丙基苯甲酸)的调控，实现了cumate对目的基因表达的调控，并且可通过诱导剂cumate的浓度及诱导时间对目的蛋白的表达量进行控制。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统构建的质粒载体和应用。

背景技术

谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)是一种革兰氏阳性细菌，最早是在1957年由日本学者从土壤中分离得到，因其可以分泌大量的L-谷氨酸而得名。谷氨酸棒杆菌是微生物发酵工业生产氨基酸的经典菌种，具有高产谷氨酸、生长迅速等优点，可以生产氨基酸、外源蛋白和化合物，涉及食品、医药和化工等领域。

Cumate诱导系统来源于恶臭假单胞菌F1(Pseudomonas putida F1)，目前这个系统已经开发用于基因的表达，并且应用到多种生物体，包括哺乳动物细胞、大肠杆菌、链霉菌、以及革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌。除此之外，Cumate诱导系统还用于一些重组酶的表达，如Cre重组酶。Cumate诱导系统主要由四部分组成，包括阻遏蛋白CymR、操纵基因CuO、控制CymR基因表达的启动子和控制CuO基因表达的强启动子。未诱导时，阻遏蛋白CymR与操作基因CuO结合，阻止目的基因的转录。加入cumate诱导后，cumate与CymR结合，使其与操纵基因分离，诱导目的基因转录。

目前，在谷氨酸棒状杆菌中常用的诱导型启动子是来自大肠杆菌的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷,isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)诱导的P_tac启动子和L-阿拉伯糖诱导的P_BAD启动子，还有无水四环素诱导的P_tet启动子。IPTG诱导的P_tac启动子在谷氨酸棒状杆菌中泄露表达严重，诱导剂IPTG具有毒性、会影响菌的生长，且IPTG价格昂贵，不适用于工业生产。P_BAD启动子的诱导剂是L-阿拉伯糖，L-阿拉伯糖是一种碳源，会受到宿主碳代谢的调节和潜在的碳源利用的影响，从而被消耗。而无水四环素诱导的P_tet启动子，诱导后表达量太低(Zhang Y,Shang X,Lai S,et al.Development and application of anarabinose-inducible expression system by facilitating inducer uptake inCorynebacterium glutamicum.[J].Appl Environ Microbiol,2012,78(16):5831-5838.)。

优良菌株的获得需要进行代谢工程、基因工程等改造，调控严格的诱导系统对酶和外源基因、蛋白的表达是十分重要的，然而谷氨酸棒状杆菌的诱导型启动子较少且都存在一定程度的泄露表达。严格控制的诱导系统具有两个特点：1.在诱导前受严格的调控，不表达目标基因；2.诱导后，转录水平高，可以高效地启动外源基因的转录。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种适用于谷氨酸棒状杆菌的cumate诱导系统及该诱导系统构建的质粒载体和应用。

本发明可为谷氨酸棒状杆菌提供一种新的严格控制的表达系统，在代谢工程、合成生物学研究和工业蛋白生产中可应用于控制基因的表达。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。