[发明专利]一种制备高效核酸酶的方法及其应用

说明书

本发明提供一种制备高效核酸酶的方法，该方法包括：克隆重组如SEQ ID No.1或者SEQ ID No.2所示的高效核酸酶基因到载体，将该重组载体转化至酵母细胞，筛选基因组中重组该基因的酵母细胞，对该重组酵母细胞进行诱导表达，分离纯化高效核酸酶。本发明的制备方法实现了在产业上高效的表达高效核酸酶，其表达的N段截短的高效核酸酶具有更好的酶活性，能广泛应用于亚单位疫苗中抗原蛋白的制备。

技术领域

本发明涉及一种制备高效核酸酶的方法及其应用，属于生物制药领域。

背景技术

核酸广泛存在于原核生物、真核生物和病毒中，是亚单位疫苗生产制备过程中的非必须成份，将其有效去除有利于降低下游产物分离纯化的成本、提高疫苗品质。传统的核酸去除方法主要是超声法和DNase/RNase酶法，但其操作周期较长，且核酸去除效率低，无法满足规模化生产的需求。全能核酸酶(以下简称SM-Nu)，是来源于粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的一种核酸内切酶，该酶能够在非常广泛的条件下降解所有形式的(双链、单链、线状、环状)DNA和RNA，生成含有5'-磷酸末端的3-5个寡核苷酸残基片段。目前，SM-Nu已通过大肠杆菌原核表达系统获得可溶性表达，但由于SM-Nu存在一定的细胞毒性，致使其表达水平受到了一定的限制。

酵母真核表达系统可实现外源蛋白的分泌表达，且培养成本低、表达产物易分离纯化，利用该系统表达外源蛋白具有自身的优势。

因此，现有技术中亟需提供一种SM-Nu的高效表达方法，以及SM-Nu在制备抗原蛋白中的应用。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种制备高效核酸酶的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)克隆所述高效核酸酶的基因，重组到载体，得到包含有所述高效核酸酶基因的载体，其中，所述高效核酸酶基因如SEQ ID No.1所示，或者所述高效核酸酶基因如SEQID No.2所示；步骤(2)将所述包含有高效核酸酶基因的载体转化至酵母细胞，筛选基因组中重组有所述高效核酸酶基因的酵母细胞；步骤(3)对所述基因组中重组了所述高效核酸酶基因的酵母细胞进行诱导表达，得到分泌表达的所述高效核酸酶；以及步骤(4)分离所述分泌表达的高效核酸酶，纯化，得到所述高效核酸酶。

本发明对来源于粘质沙雷氏菌的全能核酸酶，按毕赤酵母偏爱密码子优化的原则，利用化学法合成，得到本发明的高效核酸酶基因。本发明制备方法实现了在表达体系中高效核酸酶的高表达量表达，其表达量分别达到0.2mg/mL、0.25mg/mL，实现了产业上的应用。

作为本发明的一种实施方式，本发明的方法中，所述步骤(1)中所述载体为pPICZɑA载体，所述步骤(2)中所述酵母细胞为酵母GS115株；所述步骤(3)中所述诱导的诱导剂为甲醇。

通过测定，本发明所述毕赤酵母表达的高效核酸酶基因在毕赤酵母中的表达量达到0.2mg/mL；酶活性为50KU/mL。

当将截去N端区域(截短后的高效核酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，表达的截短后的高效核酸酶活性明显增强，酶活性达到500KU/mL，且表达量达到0.25mg/mL。

本发明还提供了一种抗原蛋白的纯化方法，其中，所述纯化方法包括：步骤(1)将表达所述抗原蛋白的细胞破碎裂解，释放胞内表达的所述抗原蛋白；步骤(2)在所述步骤(1)的所述裂解释放的抗原蛋白中添加所述方法制备的高效核酸酶，酶解所述破碎细胞中的核酸；以及步骤(3)待所述步骤(2)的所述酶解完成后，分离所述抗原蛋白。

作为本发明一种实施方式，本发明的所述抗原蛋白的纯化方法中，所述步骤(2)中所述细胞为原核细胞；优选地，所述细胞为E.coli。

作为本发明一种实施方式，本发明的所述抗原蛋白的纯化方法中，所述步骤(2)中所述酶解温度为16℃。