[发明专利]适用于雪茄烟不同组织基因表达分析的内参基因及其应用

说明书

本发明涉及适用于雪茄烟不同组织基因表达分析的内参基因及其应用。本发明通过geNorm、NormFinder和BestKeeper三个分析软件对RPL8、RPL14A、RPS16、UBC27、UBC28、UBC35、AC10、EIF2、PSAP和CPI十个候选内参基因在雪茄烟不同发育时期不同组织(根、茎、叶、花萼、花冠、柱头、子房、雄蕊、雌蕊和种子)中的表达稳定性进行了分析。结果表明RPL14A和/或UBC27基因在雪茄烟不同发育时期不同组织中稳定表达，即RPL14A和/或UBC27基因能够作为雪茄烟不同组织荧光定量PCR的内参基因。本发明进一步提供了RPL14A基因和UBC27基因的qRT‑PCR引物，为雪茄烟不同组织基因表达的精确定量分析奠定了基础。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及适用于雪茄烟不同组织基因表达分析的内参基因及其应用。

背景技术

雪茄烟(Nicotiana tabacum L)是全部由烟叶卷制成的圆或方形的吸用烟卷，是一类特殊烟草制品。雪茄烟是纯天然烟草制品，是原始烟叶经过调制(风干、晾制)、发酵、醇化过程后卷制而来，其香气纯正浓郁，吃味口感舒服，且主要有害成分(焦油和盐碱量)含量少，因此对人体身体损害小，目前市场前景广阔，经济价值十分可观。按照在烟草产品中的用途，国内普遍称雪茄原材料烟叶分为外包皮、内包皮和芯叶，即茄衣、茄套和茄芯。其中，茄衣是雪茄的外衣，是雪茄烟中最漂亮、最昂贵，也是唯一被消费者看到的重要部分。

目前，世界上优质雪茄烟叶主要产于古巴、美国、厄瓜多尔、印尼等国。我国生产的雪茄茄衣质量远远达不到优质水平，因此，国内优质茄衣原料的匮乏，严重制约了我国雪茄产业的快速发展。良好品种的缺乏和现有品种的退化成为茄衣烟叶的主要问题。随着分子生物学、遗传学的快速发展，从茄衣基因的角度研究并改良现有品种成为可能。

利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因表达水平是现代分子生物学中的重要研究手段，具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点。在qRT-PCR中，对目标基因相对表达量的分析主要通过内参基因的均一化来确定，因此，选择合适的内参基因非常关键。理想的内参基因应该是在不同发育阶段和不同组织器官中稳定表达，且表达量不受其他外界因素、实验条件的影响。在分析雪茄茄衣基因表达过程中需要使用内参基因。

一般来说，由于看家基因广泛参与有机体的基本生化反应，因此常作为内参基因来使用。目前常用的内参基因有肌动蛋白家族(ACTIN)、核糖体蛋白基因(Ribosomalprotein L,RPL)、转录延伸因子基因(Elongation factors 1alpha,EF-1α)、多聚泛素酶基因(ubiquitin,UBQ)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)、β微管蛋白基因(tubulin,TUB)等。但是，这些广泛应用的内参基因在不同植物品种及不同实验条件下的表达并不稳定；迄今为止，关于雪茄烟内参基因筛选几乎没有报道。因此，雪茄烟中内参基因的选择仍存在盲目性。

发明内容

本发明的目的是提供适用于雪茄烟不同组织基因表达分析的内参基因，所述内参基因为RPL14A基因或UBC27基因，在雪茄烟不同生长时期的不同组织中具有良好的稳定性，为准确定量分析雪茄烟功能基因转录表达水平奠定基础。

本发明的第二个目的在于提供上述RPL14A基因或UBC27基因作为内参基因在qRT-PCR检测雪茄烟不同组织基因转录表达水平中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供了适用于雪茄烟不同组织基因表达分析的内参基因，所述内参基因为RPL14A基因或UBC27基因，所述RPL14A基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；所述UBC27基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

进一步的，所述RPL14A基因的扩增引物为：