[发明专利]用于链霉素耐药结核分枝杆菌的核酸快速检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于链霉素耐药结核分枝杆菌的核酸快速检测试剂盒及其检测方法，针对rpsl Wild type基因、rpsl K43R和rpsl K88R耐药突变基因片段3个基因，设计一系列特异性crRNA,可灵敏、特异检测到链霉素耐药结核分枝杆菌核酸。本发明系首次采用Cas12a RR检测链霉素耐药结核分枝杆菌，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、高通量、肉眼可直接判读和不依赖大型实验设备等优势。这些优势使得本发明开发的基于Cas12a RR荧光法方法方便用于临床一线对链霉素耐药结核分枝杆菌核酸的快速检测和鉴定诊断。

技术领域

本发明涉及生物科技领域，尤其涉及一种用于链霉素耐药结核分枝杆菌的核酸快速检测试剂盒及其制备方法，更具体的说，涉及对链霉素耐药结核分枝杆菌rpsl基因Lys43Arg和Lys88Arg突变位点核酸的快速诊断试剂盒及其检测方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病，主要是肺结核，也有其他器官结核(肺外结核)。目前全世界范围内约有17亿人感染了结核分枝杆菌，这些感染者在一定条件下(如免疫力下降、其它疾病侵袭时)都有发展为结核病的可能。而当这些活动性结核病患者通过咳嗽、喷嚏等方式将细菌排放到空气中时，就会造成结核分枝杆菌的传播。尽管人类早在一个多世纪前就发现了结核分枝杆菌(M ycobacterium tuberculosis，M.tb)，但是全世界每年仍然约有1000万人新增结核病患者，其中中国2018年新增结核病约90万例。根据2019年WHO全球结核统计报告统计，2018年全球约有150万人因肺结核死亡，并且随着结核治疗药物和抗生素的广泛和不合理的使用，结核分枝杆菌耐药越发严重，在2018年，大约有50万结核患者发展为多重耐药，约有25万人死于多重耐药结核分枝杆菌感染。其中链霉素(Streptomycin,STR)是治疗结核病最经典一线药物的组成部分，链霉素耐药最常见的突变是rpsL基因的Lys43Arg和Lys88Arg替代，这两个位点的耐药突变率高达80-90％。并且链霉素耐药占所有一线抗结核药物耐药的60％以上。此外，印度、中国和俄罗斯三国结核耐药发病人数占全球45％。

这给结核病的防控带来了巨大的压力，也是结核病死亡率居高不下的主要原因之一，肺结核已经成为全球十大死亡原因之一，也是世界范围内单一感染源(排在HIV/AIDS之上)的主要死亡原因。临床研究发现，及时准确的诊断及规范化、足疗程的治疗，大多数结核病及耐药结核病患者能治愈，从而减少了这种慢性传染病的进一步传播。目前卡介苗BCG作为预防结核感染唯一的疫苗，仅在儿童中有效，对成人肺结核不具备免疫保护效果。

目前耐药结核病细菌学检查方法主要是耐药结核分枝杆菌药敏试验(drug sensitivity test，DST)、Xpert MTB/RIF、荧光定量PCR溶解曲线法和全基因组测序法(whole genome sequencing，WGS)。药敏试验仍是许多国家诊断耐药肺结核的“金标准，”但由于其设备需求昂贵、污染率高，该类实验耗费时间过长，不利于疾病的早期诊断和治疗；此外，Xpert MTB/RIF、荧光定量PCR溶解曲线法需要特定的仪器，样本要求高，敏感性一般，不报告具体的突变类型；全基因组测序法耗时长、仪器设备要求高、样本要求高、费用较高，绝大部分地区未普及。这给临床耐药结核病的诊断带来了很大的局限性，耐药结核分枝杆菌低阳性检出率给患者的早期诊断带来了很大障碍，由于缺乏快速灵敏的检测手段，很大一部分耐药结核病患者未能得到及时正规救治，给疾病传播的控制提供了很大的难度。诊断的延误是耐药结核病传播和出现死亡的主要原因，切断传染源，且使耐药结核病患者得到及时、规范化治疗，可有效减轻致残率及死亡率，因此早期、快速、灵感的检测手段尤为重要。因此，耐药结核病的早期诊断作为降低传染率、改善预后的的必要条件，我们迫切需要找到更敏感、特异高且成本较低的耐药结核病实验室检测手段，以期通过早发现、早诊断、进一步的规范化治疗，改善患者的预后，减少这种慢性传染病的传播。