[发明专利]体外增殖自然杀伤细胞的方法

说明书

本发明是关于一种体外增殖自然杀伤细胞的方法，由周边血液单核细胞中培养并增殖自然杀伤细胞，包括使用微量白介素‑2促进细胞增殖并活化自然杀伤细胞，该方法可明显提高细胞生长倍数及自然杀伤细胞所占比例，并且所得到的自然杀伤细胞可用于制备肿瘤疫苗等医药组成物。

【技术领域】

本发明是关于一种体外增殖自然杀伤细胞(natural killer cell,NK cell)的方法，特别是一种使用低浓度白介素-2的自然杀伤细胞增殖方法。

【先前技术】

癌症是有关细胞异常增生的复杂疾病。癌细胞与正常细胞有许多不同之处，包含：(1)细胞讯息传递：相较于正常细胞，癌细胞对于调控细胞生长或死亡的讯息较不具反应性；(2)侵犯能力：有些癌细胞会表现较少量的细胞黏附分子，因此较不受限制，可通过血液或淋巴系统轻易转移或扩散至身体其他部位；(3)细胞特化：相较于正常细胞，癌细胞为未特化或分化程度较低的细胞；及(4)免疫抑制：癌细胞可通过活化免疫抑制细胞及/或刺激免疫抑制因子的表现来抑制免疫反应。

常见的抗癌疗法包含外科手术、放射治疗及化学治疗。然而，除了抑制肿瘤生长，该些治疗方法往往伴随着伤害或毒杀正常组织的风险。此外，用于毒杀癌细胞而不产生副作用的替代性疗法尚在研究及临床前试验阶段，其中免疫治疗是最具潜力的治疗策略之一，其通过活化肿瘤专一性免疫细胞(例如T细胞、B细胞、树突细胞、自然杀伤细胞及自然杀伤T细胞)及/或刺激抗肿瘤因子的表现/释放来达到清除肿瘤的目的。该些经活化的免疫细胞可通过辨识和结合至过量或仅表现于癌细胞的肿瘤相关抗原，而专一地目标癌细胞。特别的是，自然杀伤细胞表面缺乏专一性抗原受体，因此其引发的免疫反应为非专一性防御。自然杀伤细胞位于周边血液中，可攻击肿瘤细胞及受病毒感染的细胞，当自然杀伤细胞与这些异质细胞接触后，即驱动其活化受体而活化其自身，并释出穿孔素及颗粒溶解酶等因子；穿孔素将在目标异质细胞膜形成孔洞，接着颗粒溶解酶进入该目标异质细胞后，改变粒线体膜的通透性，并活化细胞凋亡相关的蛋白质以启动细胞凋亡反应。

利用自然杀伤细胞治疗癌症有各种优势：(1)可毒杀癌细胞，抑制肿瘤的生长及扩散；(2)抑制肿瘤附近新血管的增生，限制肿瘤取得所需养分，进而限制肿瘤生长；(3)直接改善并调节患者的免疫力及神经系统；(4)副作用低或几乎无副作用。研究指出，自然杀伤细胞的毒杀范围除了黑色素瘤、头颈癌，还包括肺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、肝癌、胰脏癌、食道癌、乳癌及许多合并的癌症，尤其对肺、淋巴组织、食道、乳房、肝等血流旺盛且血管较密集部位的癌症较有效。

然而，自然杀伤细胞仅占人体周边血液中淋巴细胞的5％至10％，因此于体外高效率扩增自然杀伤细胞是一重大课题，目前研究者仍极力于提升自然杀伤细胞的体外扩增效率、其细胞存活率、细胞纯度及细胞毒杀活性，进而提升其于医疗上的应用性。

【发明内容】

有鉴于此，发明人致力于研究如何提升体外增殖自然杀伤细胞的效率。白介素-2、白介素-12、白介素-15、白介素-18及白介素-21等具有刺激自然杀伤细胞增殖并活化自然杀伤细胞的作用，目前已应用于自然杀伤细胞体外增殖技术，发明人从中进一步探讨较有效增进自然杀伤细胞增殖的选项及其条件，因而研发出本发明之方法。

本发明提供一种体外增殖周边血液单核细胞中自然杀伤细胞的方法，包括下列步骤：(a)取得一个体的一周边血液样本；(b)由该周边血液样本取得一血浆及一周边血液单核细胞；(c)使用一第一培养基将该周边血液单核细胞的浓度调整为第一浓度后接种并培养5天，其中该第一培养基包含该个体的一血浆；(d)去除上一步骤的培养基，使用一第二培养基将该周边血液单核细胞的浓度调整为该第一浓度后接种并培养2天，其中，该第二培养基包含该血浆及一白介素-2，该白介素-2的浓度为0.3μg/mL至0.5μg/mL；及(e)重复步骤(d)约2至5次，直至该周边血液单核细胞增殖至所需数量。

在一较佳实施例，该个体是人类。

在一较佳实施例，该个体是健康个体或肿瘤患者。