[发明专利]基于LEPR单克隆抗体特异性识别细胞分选系统的应用

说明书

本发明公开了一种基于LEPR单克隆抗体特异性识别细胞的分选系统，包含以下组分：LEPR单克隆抗体、荧光二抗和毛囊真皮乳头细胞，所述LEPR单克隆抗体特异性标记毛囊真皮乳头细胞，所述荧光二抗特异性标记所述LEPR单克隆抗体。本发明的LEPR单克隆抗体可以特异性免疫结合DP细胞(毛囊真皮乳头细胞)，用于分选DP细胞，并且DP细胞注射到皮下具有促进毛发生长的能力，与上皮干细胞混合可以重建毛发。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种基于LEPR单克隆抗体特异性识别的哺乳动物真皮毛乳头细胞分选系统的应用。

背景技术

真皮乳头细胞(DP细胞)由中胚层发育而来，是一种特殊的间充质干细胞，在毛囊的形成和毛发生长中发挥着至关重要的作用，它所释放的信号直接调控了毛囊干细胞和毛囊中黑色素干细胞的维持、激活、生长与分化；在体外，DP细胞和毛囊干细胞混合可以重建毛囊组织再生毛发，小鼠实验证实将它注射到皮下可诱导毛发进入生长期，DP细胞由于可以分泌各种生长因子，因而也能支持皮肤干细胞、毛囊干细胞以及黑色素干细胞的体外增殖以及干性的保持，对于利用这些干细胞治疗相关疾病，比如脱发、白发、白癜风、烧伤、创伤、皮肤遗传病等有非常重要的意义。现有分离DP细胞的方法有以下3种：

1、采用微手术解剖的方式：使用解剖针、镊子和剪刀等工具用物理分离的方式将DP细胞分离出来。

2、采用转基因鼠的方法：利用转基因技术使DP细胞表达某种特异性的荧光蛋白，再利用流式细胞仪分选和收集DP细胞。如有人已采用LEF1作为启动子，表达荧光蛋白，而LEF1只在DP细胞中表达，从而可以达到通过分选荧光蛋白来分选DP细胞的目的。

3、利用耦联有生物素的CD133抗体特异性标记DP细胞，再利用流式细胞仪筛选识别生物素的荧光二抗，从而分选DP细胞。

然而，微型解剖分离DP细胞的方法耗时耗力、效率低下，而且只适用于解剖比较大的毛囊，例如小鼠胡须毛囊、人的头皮毛囊。对于小毛囊如小鼠背部皮肤毛囊则无法操作。利用转基因鼠的方法分离DP细胞，构建转基因小鼠成本比较高，而且操作复杂，繁育小鼠的过程比较漫长。利用CD133抗体标记小鼠背部皮肤毛囊DP细胞，再通过流式细胞仪分选结合有荧光二抗的DP细胞，目前只发现一种细胞膜蛋白CD133可以用来分选DP细胞，但是CD133不能特异性识别DP细胞，如图1所示，因而无法实现有效分选DP细胞。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种能够在体外特异性识别且大量分离DP细胞的方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是针对微型解剖分离DP细胞的方法耗时耗力、效率低下，而且只适用于解剖比较大的毛囊的问题，提供一种分离哺乳动物真皮毛乳头细胞的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于LEPR单克隆抗体特异性识别的细胞分选系统的应用，细胞分选系统包含以下组分：LEPR单克隆抗体、荧光二抗和毛囊真皮乳头细胞，LEPR单克隆抗体特异性标记毛囊真皮乳头细胞，荧光二抗特异性标记LEPR单克隆抗体。

进一步的，细胞分选系统分选毛囊真皮乳头细胞的方法包括如下步骤：

(1)采用酶消化法制备毛囊真皮乳头细胞悬浮液，

(2)用LEPR单克隆抗体特异性标记细胞悬液中的毛囊真皮乳头细胞，

(3)荧光二抗特异性结合LEPR单克隆抗体，

(4)根据荧光二抗的发射波长划门设置分选条件分选毛囊真皮乳头细胞。

进一步的，步骤(1)具体为以下步骤：

(1.1)选取毛发处于生长期的小鼠，断颈法处死小鼠，

(1.2)划取皮肤区域，剃掉毛发，洗净皮肤，