[发明专利]基于LEPR单克隆抗体特异性识别细胞分选系统的应用

权利要求书

1.基于LEPR单克隆抗体特异性识别细胞分选系统的应用，其特征在于，所述细胞分选系统包含以下组分：LEPR单克隆抗体、荧光二抗和毛囊真皮乳头细胞，所述LEPR单克隆抗体特异性标记毛囊真皮乳头细胞，所述荧光二抗特异性标记所述LEPR单克隆抗体。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述细胞分选系统分选毛囊真皮乳头细胞的方法包括如下步骤：

(1)采用酶消化法制备毛囊真皮乳头细胞悬浮液，

(2)用LEPR单克隆抗体特异性标记细胞悬液中的毛囊真皮乳头细胞，

(3)荧光二抗特异性结合LEPR单克隆抗体，

(4)根据荧光二抗的发射波长划门设置分选条件分选毛囊真皮乳头细胞。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)具体为以下步骤：

(1.1)选取毛发处于生长期的小鼠，断颈法处死小鼠，

(1.2)划取皮肤区域，剃掉毛发，洗净皮肤，

(1.3)预先准备10cm培养皿，放入预冷的1×PBS缓冲液，置于冰上，剪取皮肤置于培养皿中，1×PBS缓冲液洗干净，

(1.4)将真皮面朝上，用镊子撕掉真皮侧的脂肪层，不要破坏毛囊，

(1.5)取3mL 0.25％的胶原酶置于6cm培养皿中，预热至37℃，将皮肤置于胶原酶中37℃消化，消化时间为0.5h–2h，充分消化的皮肤为透明状，

(1.6)准备新的6cm培养皿，预先放入5mL室温1×PBS，将皮肤转移至新的培养皿中，轻轻洗掉胶原酶，重复2次，

(1.7)吸掉PBS，加入3mL 0.25％的胰酶，放入摇床37℃、25rpm消化20-30min，消化完转移至冰上，后面操作均在冰上或者4℃环境中，

(1.8)将皮肤剪成2mm×2mm小块，

(1.9)加入3mL含4％血清的DMEM，终止胰酶消化，用10mL移液管全体积吹打10–12次，形成细胞悬液，

(1.10)细胞悬液过40μm细胞滤器，滤液转移至50mL离心管中，

(1.11)用DMEM清洗培养皿，清洗液过40μm细胞滤器，滤液转移至50mL离心管中，

(1.12)1500rpm，4℃，离心5min，吸掉上清，

(1.13)用预冷的PBS-F缓冲液重悬细胞并计数，先用2mL PBS-F缓冲液轻轻吹匀，再加3mL重悬，毛囊真皮乳头细胞悬浮液。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述LEPR单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：

(i)用LEPR重组蛋白抗原免疫两只新西兰大白兔，ELISA方法检测血清滴度，

(ii)B细胞体外培养和上清筛选出针对特异性抗原的阳性克隆，

(iii)重组LEPR单克隆抗体，

(iv)将目标克隆进行大提质粒制备后进行转染生产，将转染上清进行ProA亲和柱纯化LEPR单克隆抗体，并进行缓冲液置换，即用PBS置换Gly-HCl，tris缓冲液，最终将LEPR单克隆抗体保存于PBS缓冲液中。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(i)中免疫部位为皮下多点注射，免疫滴度合格标准为OD_1:640000.8。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(ii)具体为：取兔子脾脏，分离B细胞，铺板，体外进行培养，加入细胞生长因子，饲养细胞，培养10-15天后进行上清检测；取上清，进行初筛，挑选针对特异性抗原的阳性克隆；将ELISA阳性克隆的上清进行WB\FC\ICC\IHC验证；将阳性克隆全部挑选出，制备细胞裂解液，保存于-80℃。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(iii)具体为取Top10克隆进行抗体重组；利用特异性PCR引物，调取重链和轻链的可变区序列；测序验证后，进行质粒构建，并制备小提质粒用于转染测试；经转染，上清ELISA检测阳性后，再进行WB\FC\ICC\IHC验证；确定阳性克隆抗体重组质粒对。