[发明专利]一种快速检测牡蛎疱疹病毒抗原的免疫荧光检测试纸条及应用

说明书

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速定性及定量检测牡蛎疱疹病毒(Ostreidherpesvirus1,OsHV‑1)抗原的免疫荧光检测试纸条及其应用。本发明提供的免疫荧光试纸条以如SEQ ID NO.1所示的ORF104蛋白作为待检抗原分子。本发明操作步骤简单，检测速度快，结果即可定性观察又可定量测量，检测成本低。本发明待检样品制备简单，只需配合组织裂解液破碎组织即可，无需繁琐的核酸抽提过程。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种快速定性及定量检测牡蛎疱疹病毒(Ostreidherpesvirus1 ,OsHV-1)抗原的免疫荧光检测试纸条及其应用。

背景技术

牡蛎疱疹病毒（OsHV-1）， 隶属疱疹病毒目（Herpesvirales），软体动物疱疹病毒科（Malacoherpesviridae），宿主范围涉及我国多个养殖双壳贝类，包括牡蛎、扇贝及毛蚶等。牡蛎疱疹病毒感染养殖贝类群体后，可导致贝类群体大规模死亡。由于双壳贝类养殖模式属于开放水体养殖，养殖贝类发病后难以施药进行治疗，因此养殖过程中对病原的风险管控显得更为重要。为实现牡蛎疱疹病毒这一病原的定期监测任务，亟待开发一种快速、高效的检测方法。

目前对于OsHV-1的检测，均基于对病毒核酸水平的检测，对从事检测操作人员业务水平要求较高；检测场所需配套相关设备、试剂储藏空间，并且需保持高度的清洁度以避免阳性样品污染。当下基于核酸检测技术处理周期较长，无法实现现场快速检测的目的。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的主要目的在于提供一种快速检测牡蛎疱疹病毒（OsHV-1）的抗原免疫荧光试纸条，该试纸条能够实现对牡蛎疱疹病毒的定性及定量检测，应用于养殖过程中OsHV-1的定期监测，实现对这一病原的风险管控；另外，可为科研人员提供一种除核酸水平之外的病毒定量方法。

本发明还提供了上述抗原免疫荧光试纸条的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种快速检测牡蛎疱疹病毒OsHV-1抗原的免疫荧光试纸条，所述免疫荧光试纸条以如SEQ ID NO.1所示的ORF104蛋白作为待检抗原分子；优化的，所述免疫荧光试纸条以如SEQ ID NO.2所示的肽段作为免疫原制备多克隆抗体。

本发明制备的免疫荧光试纸条具体包括PVC底板，底板上层依次叠放样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫；所述结合垫上设有荧光微球标记的EPI多克隆抗体；检测垫由硝酸纤维素膜构成，喷印一条包被羊抗小鼠IgG质控线C，以及一条包被EPI多克隆抗体的检测线T。

上述EPI多克隆抗体具体制备方法如下：

（1）分别利用pGEX-4-1及pET28a-SUMO质粒重组表达EPI蛋白，之后分别利用谷胱甘肽和Ni 离子偶联琼脂糖树脂进行纯化；

（2）取上述pGEX-4-1重组表达的EPI蛋白进行免疫小鼠；

（3）利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得EPI蛋白对应的小鼠多克隆抗体IgG，利用pET28a-SUMO重组表达EPI蛋白作为待检抗原。

进一步的，步骤（2）中，所述免疫时每只小鼠的免疫剂量为200μg重组蛋白，免疫次数7次。

进一步的，步骤（3）中，所述纯化后多克隆抗体的ELISA效价为1:10³~1:10⁶。

本发明还提供了一种=免疫荧光试纸条的应用，用于快速定性定量检测牡蛎疱疹病毒，具体检测方法包括以下步骤：

a.采集待检贝类外套膜样品，加入组织裂解液研磨或捣碎组织，得到待检溶液；

b.将待检溶液滴入荧光免疫检测试纸条样品垫处，水平放置3~5min观察结果；

c.采用手持式365nm左右波长紫外灯照射，进行快速定性检测；