[发明专利]一种快速检测牡蛎疱疹病毒抗原的免疫荧光检测试纸条及应用

权利要求书

1.一种快速检测牡蛎疱疹病毒（OsHV-1）抗原的免疫荧光试纸条，其特征在于，所述免疫荧光试纸条以如SEQ ID NO.1所示的ORF104蛋白作为待检抗原分子。

2.根据权利要求1所述的免疫荧光试纸条，其特征在于，所述免疫荧光试纸条以如SEQID NO.2所示的肽段作为免疫原制备多克隆抗体。

3.根据权利要求1或2所述的免疫荧光试纸条，其特征在于， 具体包括PVC底板，底板上层依次叠放样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫；所述结合垫上设有荧光微球标记的EPI多克隆抗体；检测垫由硝酸纤维素膜构成，喷印一条包被羊抗小鼠IgG质控线C，以及一条包被EPI多克隆抗体的检测线T。

4.根据权利要求3所述的免疫荧光试纸条，其特征在于，所述EPI多克隆抗体具体制备方法如下：

（1）分别利用pGEX-4-1及pET28a-SUMO质粒重组表达EPI蛋白，之后分别利用谷胱甘肽和Ni 离子偶联琼脂糖树脂进行纯化；

（2）取上述pGEX-4-1重组表达的EPI蛋白进行免疫小鼠；

（3）利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化获得EPI蛋白对应的小鼠多克隆抗体IgG，利用pET28a-SUMO重组表达EPI蛋白作为待检抗原。

5.根据权利要求4所述的免疫荧光试纸条，其特征在于，步骤（2）中，所述免疫时每只小鼠的免疫剂量为200μg重组蛋白，免疫次数7次。

6.根据权利要求4或5所述的免疫荧光试纸条，其特征在于，步骤（3）中，所述纯化后多克隆抗体的ELISA效价为1:10³~1:10⁶。

7.一种如权利要求1-6任一项所述的免疫荧光试纸条的应用，其特征在于，用于快速定性定量检测牡蛎疱疹病毒，具体检测方法包括以下步骤：

a.采集待检贝类外套膜样品，加入组织裂解液研磨或捣碎组织，得到待检溶液；

b.将待检溶液滴入荧光免疫检测试纸条样品垫处，水平放置3~5min观察结果；

c.采用手持式365nm左右波长紫外灯照射，进行快速定性检测；

d.阴性样品组织裂解液梯度稀释EPI标准品，绘制样品浓度与T/C比值间log直线回归标准曲线；测试待检样品T/C值，通过标准曲线计算样品中抗原含量，进行抗原定量检测。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤（a）中，所述组织裂解液包括0.1MTris-HCl，0.5% Tween20，1.5% TritonX-100，0.03% NaN₃。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，步骤（c）中，所述定性检测为：当检测垫质控线C和检测线T显现两荧光条带，表示待检样品中含有待检抗原；若仅质控线C显现一条荧光条带，表示待检样品中未检出待检抗原。