[发明专利]菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法

说明书

本发明公开了一种菌体中脂寡糖的提取纯化方法，包括以下步骤：a、收集干菌泥；b、将所述干菌泥与异丁酸氨水溶液混合，离心，收集上清液，所述异丁酸氨水溶液为异丁酸和浓氨水的混合物；c、将步骤b得到的上清液与乙醇混合，静置，离心，收集沉淀物；d、使用氯仿甲醇溶液对步骤c得到的沉淀物进行萃取，收集有机相；e、对步骤d得到的有机相进行干燥。本发明还公开了一种菌体中寡糖的提取纯化方法，包括对步骤e得到产物进行水解并纯化。

技术领域

本发明涉及寡糖提取纯化技术领域，特别是涉及菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法。

背景技术

百日咳(pertussis)是一种由百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis，简称百日咳杆菌)引起的急性呼吸道传染病，百日咳杆菌以人为唯一天然宿主，虽然有良好的疫苗接种覆盖率，但每年仍有大量患者并导致部分患者死亡。目前，有两种百日咳疫苗，一种为全细胞百日咳疫苗(wP)，另一种无细胞百日咳疫苗(aP)。aP虽然可以对鲍特菌感染提供保护，但不能完全阻止其传播，且aP预防感染的效果明显不如wP。很多研究已经证明，正在使用的无细胞百日咳疫苗与百日咳疾病重现有关。

百日咳杆菌菌体表面的脂寡糖(lipooligosaccharide，LOS)既是细菌的致病物质，其最外层的三糖结构也是百日咳杆菌的型特异性抗原(图1)。已经有学者证明百日咳杆菌LOS的末端三糖结构是特异性杀菌抗体作用的靶点。研究也初步证明，用O-SP-ABS制备的结合物，能使小鼠产生具有一定杀菌作用的功能性抗体。因此百日咳寡糖可能为开发新型百日咳抗原成分提供新的思路。传统的热酚水法提取LOS，提取周期长，有毒溶剂苯酚的使用会对操作人员造成伤害且终产品中会存在有毒物质的风险，去除后续产品中残留有毒物质的工艺繁琐。

发明内容

基于此，有必要针对传统热酚水法提取存在的问题，提供一种菌体中脂寡糖和寡糖的提取纯化方法。

一种菌体中脂寡糖的提取纯化方法，包括以下步骤：

a、收集干菌泥；

b、将所述干菌泥与异丁酸氨水溶液混合，离心，收集上清液，所述异丁酸氨水溶液为异丁酸和浓氨水的混合物；

c、将步骤b得到的上清液与乙醇混合，静置，离心，收集沉淀物；

d、使用氯仿甲醇溶液对步骤c得到的沉淀物进行萃取，收集有机相；

e、对步骤d得到的有机相进行干燥。

在其中一些实施例中，所述浓氨水的质量浓度为22％～28％。

在其中一些实施例中，所述异丁酸氨水溶液中的所述异丁酸与所述浓氨水的体积比为(4～6):3。

在其中一些实施例中，步骤b中，每克干菌泥中添加所述异丁酸氨水溶液8ml～12ml。

在其中一些实施例中，步骤c中上清液与乙醇的混合物中乙醇的浓度为(75～85)ml/100ml。

在其中一些实施例中，所述氯仿甲醇溶液中的氯仿与甲醇的体积比为(1～2.5):1。

在其中一些实施例中，步骤d中，先使用含MgSO₄的缓冲液对步骤c得到的沉淀物进行重悬，然后再使用氯仿甲醇溶液对重悬液进行萃取。

在其中一些实施例中，所述含MgSO₄的缓冲液的pH 7.4～7.8，MgSO₄浓度为1.5mmol/L～2.5mmol/L；优选的，每克干菌泥中所述含MgSO₄的缓冲液的使用量为5ml～10ml。

在其中一些实施例中，步骤d中使用的所述氯仿甲醇溶液与所述含MgSO₄的缓冲液的体积比为1:(1～4)。