[发明专利]一种催化乙苯等烷基苯及衍生物羟化的突变体及其应用

说明书

本发明涉及生物催化反应，具体的说是一种协同选择性催化烷基苯及衍生物羟化的突变体及其利用H₂O₂实现烷基苯及衍生物sp3C‑H键高效区域及立体选择性羟化调控合成光学纯的(S)/(R)‑苯基烷基醇的应用。突变体为细胞色素P450BM3氧化酶第87位苯丙氨酸处和第268位苏氨酸处的两个位点突变；其中，两个位点的氨基酸可相同或不同的突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸或脯氨酸。所述突变体均可应用于乙苯等烷基苯及衍生物的选择性羟化。本发明显著提高野生酶对乙苯等烷基苯及衍生物的羟化能力，大大提高乙苯等烷基苯及衍生物的附加值。

技术领域

本发明涉及生物催化反应，具体的说是一种协同选择性催化烷基苯及衍生物羟化的突变体及其利用H₂O₂实现烷基苯及衍生物sp3C-H键高效区域及立体选择性羟化调控合成光学纯的(S)/(R)-苯基烷基醇的应用。

背景技术

手性α或β位羟基烷基苯是重要的精细化学品，是香料、化妆品和药物等多个领域的重要中间体。例如，(S)-1-苯乙醇是合成抗抑郁药物氟西汀的重要前体；(R)-1-茚醇是合成长效抗抑郁药物茚达曲林的药物前体，且其R构型药效是S构型的20倍以上；(S)-1-苯基2-丙醇是合成治疗气喘和抗嗜睡药物安非他命的重要前体；(S)-四氢萘醇可用来合成JAK3抑制剂，用来治疗血液系统疾病、肿瘤、类风湿性关节炎及银屑病等。

目前手性的α或β位羟基烷基苯的化学制备主要通过三种途径：1)通过动力学拆分由外消旋的羟基烷基苯获取单一构型的产物，但该途径最大的理论收率只有50％，且需要制备原料羟基烷基苯；2)以前手性羰基烷基苯为底物进行羰基的不对称还原得到手性α或β位羟基烷基苯，该途径一般均需要过渡金属铑、钌、铱等金属催化剂结合复杂的手性配基来实现不对称催化，故成本昂贵而且反应条件不温，需要额外的试剂作氢供体。3)通过对烷基苯sp3C-H键的不对称羟化来直接制备手性α或β位羟基烷基苯，此途径具有独特优势：不需要对底物进行预氧化官能团化，且原子经济性更高；此外该途径能大大提高石化资源的高附加值利用及减少挥发性芳香有机物的污染。比较典型实例为Evgenii等利用手性Mn-氨基吡啶复合物催化乙苯生成1-苯乙醇，其R构型的ee可以达到76％，但催化过氧化现象较严重，立体选择性有待提高。针对目前化学催化现状，生物催化因温和的反应条件及在选择性方面的先天优势，越来越受到关注。

自然界中存在能天然羟化烷基苯的微生物，但种类不多，如Chen等发现假单胞菌Pseudomonasmonteilii TA-5可以催化乙苯、丙苯等不对称羟化生成R-α苯基醇，手性ee值可达94％；Yadav等发现黄曲霉Aspergillus flavus MTCC-1783和MTCC-1884羟化乙苯、丙苯的手性可达99％ee以上。由于野生菌往往受到其自身生长因素、目标酶表达量低及反应及后处理复杂等限制，均制约其实际应用。天然不对称催化烷基苯羟化的酶种类也不多，主要为苯脱氢酶、过加氧酶、细胞色素P450酶等。乙苯脱氢酶主要来源于厌氧菌，如Kniemeyer等发现来源于反硝化型弧菌Azoarcus strain EbN1的乙苯脱氢酶可高手性的羟化乙苯和丙苯生成S-α苯基醇，但此酶在粗酶液中还能保持活性，纯化后即失活，综合考到厌氧菌的本身特性，不适于实际催化应用。

过加氧酶因以H₂O₂作为末端氧化剂，催化过程简单，及高效的催化活性与选择性是目前研究的一大热点。但目前发现和研究的该类酶种类不多，如来源于Caldaromycesfumago的氯过氧化物酶可催化乙苯、丙苯等不对称羟化，催化乙苯的手性可达97％(R)；近期发现来源于Agrocybe aegerita的过加氧酶可以高效催化烷基苯苄位不对称羟化，乙苯、丙苯手性可达99％ee以上，茚满苄位羟化的手性也在87％以上，且具有良好的催化活性。但目前仅发现一种酶，且存在一些弊端，该酶均主要选择R构型且存在过氧化现象，此外过加氧酶不易异源表达和进行分子生物学操作，目前仅在酵母、黑曲霉、米曲霉中表达成功，活性损失亦较多。