[发明专利]一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒及其制备方法和检测方法

权利要求书

1.一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括CRISPR-Cas检测体系，具体包括：分子识别剂；信号转换剂；转录体系；以及缓冲液；

其中，所述分子识别剂包括：Cas蛋白和L-crRNA ，L-crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述信号转换试剂包括L-Broccoli和荧光染料，L-Broccoli的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示；所述转录体系包括启动子、phi29 DNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、dNTPs、rNTPs、DNase I，启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包含10×phi 29聚合酶缓冲液和5×转录缓冲液；其中，所述10×phi 29聚合酶缓冲液的组成分为：33 mM Tris-醋酸盐、10 mM醋酸镁、66mM醋酸钾、0.1％（v / v）吐温 20、1 mM DTT；所述5×转录缓冲液的组分为200 mM Tris-HCl、30 mM MgCl₂、 50 mM DTT、50 mM NaCl 、 10 mM 亚精胺 。

3.一种制备如权利要求1或2所述的快速检测单增李斯特菌的试剂盒的方法，其特征在于，该方法包含Broccoli适体的制备和crRNA的制备，所述Broccoli适体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Broccoli适体的制备方法包含：取5µL浓度为1～10 µM的 L-Broccoli、5 µL浓度为1～10 µM的启动子以及5µL 10×phi29聚合酶缓冲液混匀，在80～90℃变性3～5分钟，然后室温反应5～30分钟；

再加入0.2～0.5 µL浓度为10 U / µL的 phi 29 DNA聚合酶和1～5 µL dNTPs，在30℃下孵育10～60min, 孵育使其延伸形成双链；

再加入1～4 µL 浓度为20 U / µL 的T7 RNA聚合酶、5µL 5×转录缓冲液、2 µL rNTPs和水，37℃孵育1～6小时，转录结束后，加入2µL DNase I孵育去除DNA模板，灭活后即得到Broccoli适体。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述crRNA的制备方法包含：取5µL浓度为1～10 µM 的L-crRNA、5 µL 浓度为1～10 µM 的启动子以及5µL 10× phi 29聚合酶缓冲液混匀,80～90℃变性3～5分钟，然后室温反应5～30分钟；

再加入0.2～0.5 µL 浓度为10 U / µL 的phi 29 DNA聚合酶和1～5 µL dNTPs，30℃孵育10～60min, 孵育使其延伸形成双链；

再加入10 µL 浓度为20 U / µL 的1～4 µL T7 RNA聚合酶、5µL 5×转录缓冲液，2 µLrNTPs和水，37℃孵育1～6小时，转录结束后，加入2µL DNase I孵育去除DNA模板，然后灭活即得到crRNA适体。

6.一种采用如权利要求3～5任一所述的方法制备得到的快速检测单增李斯特菌的试剂盒。

7.一种单增李斯特菌的的快速检测方法，其特征在于，使用如权利要求1～2、6任一所述的试剂盒进行检测，该检测方法包含以下步骤：

（1）提取单增李斯特菌靶标RNA：采用细菌总RNA分离试剂盒提取纯化总RNA，并测定RNA浓度；

(2) 单增李斯特菌的检测：将步骤（1）中的靶标RNA，与Broccoli适体、荧光染料、crRNA和Cas蛋白混匀，孵育后检测荧光；

（3）建立单增李斯特菌浓度与荧光强度的标准曲线:将不同浓度靶标RNA，Broccoli、荧光染料、crRNA和和Cas蛋白混匀，孵育后检测荧光，根据荧光结果绘制单增李斯特菌浓度与荧光强度的标准曲线。