[发明专利]一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法

说明书

本发明公开了一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法。本发明从优势流行菌株中筛选出免疫原性良好的副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株作为疫苗制备菌株，分别划线接种于TSA固体培养基，TSB培养基上培养，再放大到改进后的发酵罐上培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后，离心浓缩，再加入佐剂混合乳化制成副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，该疫苗用于预防由4、5、12型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病，具有安全性好、免疫效力高且免疫期长等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌病是1906年德国科学家格拉泽发现的，故又称格拉泽氏病。副猪嗜血杆菌是猪上呼吸道的常在菌，在特定条件下如环境改变、其他细菌病毒感染的条件下能够侵入机体的多种组织系统中引起全身症状，临床上以“六炎四水”为病变特征，即胸膜炎、腹膜炎、关节炎、心包炎、肺炎、脑膜炎，胸腔、腹腔、关节、颅腔积液；临床表现为精神沉郁高热，食欲不振厌食消瘦，关节肿胀跛行，咳嗽呼吸困难，粘膜发绀等症状。该病呈世界性分布，已成为全球范围内危害养猪业的最主要细菌性传染病之一，并已证实在中国绝大多数猪场存在和流行。本病只感染猪，主要是断奶前后仔猪和保育猪，患猪或带菌猪通过空气、接触、消化道传播感染，可影响2周龄～4月龄猪，常见于5-8周龄猪，发病率一般为10％～15％，严重时死亡率可达50％以上。

目前国际认可的副嗜血杆菌有15个血清型，其中我国主要以4型和5型最为流行，其次流行血清型主要为12型、13型和14型。

目前我国副猪嗜血杆菌病商品化灭活疫苗是以血清型4型和5型制备的二价苗为主。虽然二价疫苗的应用对该病起到了一定的预防作用，但多种血清型感染已经使现有疫苗很难达到预期的免疫效果。

另一方面，现有疫苗制备方法中，存在以下问题：(1)在菌液发酵罐培养过程中，溶氧量需控制在50％～60％，在培养量为70％时，在生长高峰期耗氧量增大，容易导致溶氧量不足；(2)副猪嗜血杆菌抗原基本上是采用先浓缩再灭活的方式，浓缩过程容易散毒、菌液失活，且在生产过程中菌失活后容易裂解产生内毒素。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种发酵罐以及副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，该疫苗用于预防由4、5、12型副猪嗜血杆菌引起的猪副嗜血杆菌病，具有安全性好、免疫效力高且免疫期长的优点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明首先提供一种发酵罐，包括罐体，罐体的顶部设有罐口，罐体的顶部连接有进料管，罐体的底部连接有出料管，罐体的侧壁上设有加热夹套，加热夹套上设有进水口和出水口，所述的罐体顶部还设有补料口和进气口，罐体的下部设有取样口，所述罐体内设有搅拌轴和至少一个搅拌桨，所述搅拌轴一端与设置在罐体顶部的驱动电机连接，搅拌轴另一端与搅拌桨连接；所述发酵罐还包括环形通气装置和空气管道，所述空气管道通过从罐体顶部伸入罐体内的下部，空气管道的底部与环形通气装置一端连接，环形通气装置的环形面与罐体底部平行设置。

所述环形通气装置由不锈钢管成型。环形通气装置上间隔设有多个不同朝向的通气孔。

所述空气管道上设有流量控制器。所述搅拌桨的数量为四个，四个搅拌桨沿搅拌轴长度方向间隔设置。

所述罐体的下部还设有温度电极口、溶氧电极口和pH电极口。所述进料管、补料口和出料管上设有过滤网。

采用本发明发酵罐的副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

S1：生产用种子的制备

分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养24～48小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养24～48小时；