[发明专利]一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1. 一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：生产用种子的制备

分别将副猪嗜血杆菌4型H25株、5型H45株、12型H31株冻干菌种溶解，划线接种于TSA培养基，置37℃培养24～48小时，分别选取单个典型菌落划线接种于TSA培养基，37℃培养24～48小时；

用TSB培养基洗下固体培养基上的一级种子，接种于TSB液体培养基中，37℃ 振荡培养8～10小时，取样纯粹检验合格后，作为二级种子液；

S 2：制苗用菌液的制备

S 2-1：菌液培养

采用发酵罐分别对4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的二级种子进行培养：按发酵罐容积的70～80％加入TSB培养基，同时加入0.01%～0.02%消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待温度降至37～38℃时，分别加入10％新生牛血清、10～20μg/mL NAD和2％～4％二级种子液进行发酵培养，培养温度为37℃、搅拌转速为100～150 r/min，溶氧值控制在50%-60%，菌液培养8～10小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验；

S 2-2：活菌计数

4型H25株、5型H45株、12型H31株菌种的培养菌液活菌数均应大于等于6×10⁹CFU/mL；

S 2-3：灭活浓缩

在4型H25株、5型H45株、12型H31株的培养菌液中分别计量加入终浓度为0.2～0.4％甲醛溶液，37℃搅拌灭活24～30小时，灭活结束后取样进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存；

分别将4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，置于2～8℃保存，根据活菌计数结果，均稀释至1.8×10¹⁰CFU/mL，分别得到4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原；

S 3：半成品检验

上述4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活菌液分别经过纯粹检验、灭活检验、毒素检验，检验结果均合格；

S 4：疫苗制备

将检验合格的4型H25株、5型H45株、12型H31株灭活抗原等比例混合后，在搅拌器中缓慢搅拌混匀，再缓慢加入GEL佐剂，搅拌5min～10min，直至完全混合均匀，再加入终浓度0.01%的硫柳汞钠溶液，乳化后即得到副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗，置于4℃保存。

2. 根据权利要求1所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S 2-1中，菌液培养条件为：培养温度为37℃，搅拌转速为100～150 r/min，溶氧值控制在50%-60%。

3. 根据权利要求1 所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S 4中，4型H25株、5型H45株、12型H31株抗原的总量与佐剂的质量比为9：1。

4. 根据权利要求1 所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S 4中，所述佐剂为GEL佐剂、油佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂、ISA201VG佐剂中的一种。

5. 根据权利要求1 所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：步骤S 2-1中，所述发酵罐包括罐体，罐体的顶部设有罐口，罐体的顶部连接有进料管，罐体的底部连接有出料管，罐体的侧壁上设有加热夹套，加热夹套上设有进水口和出水口，所述的罐体顶部还设有补料口和进气口，罐体的下部设有取样口，所述罐体内设有搅拌轴和至少一个搅拌桨，所述搅拌轴一端与设置在罐体顶部的驱动电机连接，搅拌轴另一端与搅拌桨连接；所述发酵罐还包括环形通气装置和空气管道，所述空气管道从罐体顶部伸入罐体内的下部，空气管道的底部与环形通气装置一端连接，环形通气装置的环形面与罐体底部平行设置。

6.根据权利要求5所述的一种副猪嗜血杆菌三价灭活疫苗的制备方法，其特征在于：所述环形通气装置由不锈钢管成型，所述环形通气装置上间隔设有多个不同朝向的通气孔。