[发明专利]用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的引物探针、靶标组合、试剂盒和方法

说明书

本发明涉及病毒检测技术领域，具体公开了用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的引物探针、靶标组合、试剂盒和方法。本发明的用于分别或同时检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的实时荧光定量RT‑PCR检测的引物探针组合，含有三对特异性引物和三条特异性探针，其中，所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1‑6所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.7‑9所示。采用所述引物探针组合进行检测时，具有较高的特异性和灵敏性，可重复性好，检测简便快速，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，具体地说，涉及一种用于检测拉蒂诺病毒、莫巴拉病毒和莫佩亚病毒的引物探针、靶标组合、试剂盒和方法。

背景技术

沙粒病毒由外膜和核衣壳组成，呈圆形，含有脂质(外)胞膜，直径约为50-300nm(平均110-130nm)。外膜表面覆盖有一种蛋白组成的、长度约10nm的纤突，内部可见不同数量的来自宿主细胞的核糖体，在电镜下形如沙粒样，沙粒病毒因此而得名。病毒基因组由双向分节段的单股负义链RNA组成，较大的为L片段，长度约7400个核苷酸，编码RNA依赖的RNA聚合酶L蛋白和具有转录复制调节功能的Z蛋白；较小的为S片段，长度约3400个核苷酸，编码核蛋白NP和糖蛋白GP。L和S片段在病毒粒子中并非等量，而是以2：1的摩尔比存在。每个片段上的基因分别被含有发卡结构非编码区隔开，5’端无帽状结构，3’端序列保守。由于S片段较L片段更为保守，因此常用S片段进行病毒进化研究和分类鉴定。

根据ICTV(国际病毒学分类委员会)2018年最新颁布病毒分类(https://talk.ictvonline.org/taxonomy/)，沙粒病毒科分为4个属：Antennavirus、Hartmanivirus、Mammarenavirus和Reptarenavirus，包含43个种。哺乳动物沙粒病毒属(Mammarenavirus)中35个种可分为旧世界沙粒病毒和新世界沙粒病毒，旧世界沙粒病毒中，代表病毒是淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒简称LCMV病毒。新世界沙粒病毒主要包括有4个clade，clade A有Pirital，Pichinde，Flexal，Parana和Alloahuayo virus五种病毒；cladeB有Junin,Machupo,Guanarito,Amapari,Tacaribe,Sabia,Cupixi和Chapare viruses八种病毒；clade C有Oliveros和Latino两种病毒；clade A/Rec包括有Whitewater Arroyo,Tamiami和Bear Canyo三种病毒；系统进化树显示Lujo virus属于新世界沙粒病毒，但不在四个clade中。目前，已发现对人致病的沙粒病毒主要有拉沙病毒(Lassa virus)引起拉沙热，胡宁病毒(Junin virus)引起阿根廷出血热，马秋波病毒(Machupo virus)和查帕雷病毒(Chapare virus)引起玻利维亚出血热，卢约病毒(Lujo virus)引起卢约出血热，瓜纳瑞托病毒(Guanarito virus)引起委内瑞拉出血热，萨比亚病毒(Sabid virus)引起巴西出血热，淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)引起淋巴细胞脉络丛脑膜炎。

拉蒂诺病毒于1973年在玻利维亚胼胝暮鼠(Calomys callosus)中首次被发现，该病毒主要局限于玻利维亚的啮齿类动物中传播；莫巴拉病毒于1983年在中非共和国柔毛鼠(Arvicanthis sp)首次被发现，该病毒主要局限于中非的啮齿类动物中传播；莫佩亚病毒于1977年在坦桑尼亚莫洛戈罗地区的多乳鼠(Mastomys natalensis)首次被发现。目前，该病毒主要局限于津巴布韦、莫桑比克地区的啮齿类动物中传播。

病毒病实验室检测主要依靠于病毒分离、血清学检测和病毒核酸检测。病毒核酸检测主要是基于PCR技术，实时荧光定量RT-PCR有着快速、高灵敏度和特异度的优点，是目前运用较多的实验室检测方法。该方法基于荧光共振能量迁移的原理，通过对荧光强度变化监测产物量的变化，随着反应时间的进行，将监测到的荧光信号的变化绘制一条曲线。该方法全程闭管操作，降低了污染的风险；对PCR产物除了可以进行定性分析，也可通过绘制标准曲线进行定量分析。