[发明专利]一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，包括以下步骤：步骤一：在实验前一天晚上20：00，将两条雄性斑马鱼与两条词性斑马鱼或一对一置于同一个交配盒中，用隔板将两者分开，第二天早上8：30，待到试验药剂准备好后，将隔板打开，将交配盒的水位下降，收集受精的斑马鱼胚胎至培养皿中，用于显微注射或置于28.5℃恒温生化培养箱中培养，每天吸走死卵换水，胚胎的收集一般根据受精的时间，实时的发育阶段进行，用于原位杂交的斑马鱼胚胎须在24hpf左右换入含0.03g/L PTU eggwater，以达到抑制黑色素生成的目的，对要养殖的鱼来说，一般在4pdf在交配盒中饲养，待一个月大，放置系统进行饲养。

技术领域

本发明属于动物模型技术领域，具体涉及一种心血管疾病药物筛选斑马 鱼动物模型的构建方法。

背景技术

Heg1(heart of glass)基因是一种跨膜受体，2003年由John D.Mably在 斑马鱼ENU筛选中鉴定出的一种胚胎隐性致死突变，具有心房心室特异性增 大、血流迟滞的心血管疾病表型，Heg1主要调控心脏与血管细胞—细胞间的 粘附性，在小鼠中研究显示heg1基因突变会导致内皮屏障减弱，引发败血症、 动脉粥样硬化和多发性硬化等心血管疾病，在人类、小鼠和大鼠中均能检测 到heg1的同源基因，这就使得heg1突变体中得到的实验数据应用于人类临 床提供了可能性，CRISPR/Cas9基因编辑技术是一种精确便捷的基因编辑方式，用于目标基因片段的定点插入、删除、激活，1987年，日本学者首次在 Escherichiacoli染色体上发现的了CRISPR，CRISPR/Cas9是一种由RNA引 导的核酸内切酶，通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的 定点编辑，CRISPR序列在前导区的调控下，转录出RNA前体经一系列加工为 的crRNA，同时转录出反式激活crRNA，与RNaseⅢ—同形成成熟的crRNA， 其中crRNA和tracrRNA部分互补配对形成双链RNA，由于其作用是引导Cas9 靶向切割DNA，随后gRNA和Cas9形成切割复合体，Cas9蛋白识别目的DNA 的PAM位点，gRNA上的序列与基因组DNA序列进行碱基互补配对，随后，复 合体上的Cas9蛋白将gRNA所识别的序列进行切割，造成DNA双链的断裂； RuvC则参与另一条链的切割，最终导致双键断裂，在DNA修复过程中，随机 插入或缺失一部分碱基，产生移码突变或错误修复，从而完成对敲除靶基因 的目的。

但是其在实际使用时，难以得到遗传稳定的心血管畸形斑马鱼突变体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种心血管疾病药物 筛选斑马鱼动物模型的构建方法，以解决上述背景技术中提出的难以得到遗 传稳定的心血管畸形斑马鱼突变体的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种心血管疾病药物筛选 斑马鱼动物模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤一：在实验前一天晚上20：00，将两条雄性斑马鱼与两条词性斑马 鱼或一对一置于同一个交配盒中，用隔板将两者分开，第二天早上8：30，待 到试验药剂准备好后，将隔板打开，将交配盒的水位下降，收集受精的斑马 鱼胚胎至培养皿中，用于显微注射或置于28.5℃恒温生化培养箱中培养，每 天吸走死卵换水，胚胎的收集一般根据受精的时间，实时的发育阶段进行， 用于原位杂交的斑马鱼胚胎须在24hpf左右换入含0.03g/L PTUegg water， 以达到抑制黑色素生成的目的，对要养殖的鱼来说，一般在4pdf在交配盒中饲养，待一个月大，放置系统进行饲养；

步骤二：在显微注射之前，根据实验需要，将体外合成的mRNA， morpholino，DEPC处理水或质粒与适当比例的酚红按照设置好的浓度配置好；

步骤三：将3％的琼脂糖溶于鱼卵水中，在微波炉里融化，冷却至60摄氏 度左右，将大约30ml琼脂糖溶液导入培养皿中，然后将一个特制带有小楔形 孔或带有长条的模具置于琼脂糖溶液上面，待其自然冷却，将磨具在琼脂糖 表面移走，制得用于单细胞显微注射的平板；