[发明专利]一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法

权利要求书

1.一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：在实验前一天晚上20：00，将两条雄性斑马鱼与两条词性斑马鱼或一对一置于同一个交配盒中，用隔板将两者分开，第二天早上8：30，待到试验药剂准备好后，将隔板打开，将交配盒的水位下降，收集受精的斑马鱼胚胎至培养皿中，用于显微注射或置于28.5℃恒温生化培养箱中培养，每天吸走死卵换水，胚胎的收集一般根据受精的时间，实时的发育阶段进行，用于原位杂交的斑马鱼胚胎须在24hpf左右换入含0.03g/L PTU egg water，以达到抑制黑色素生成的目的，对要养殖的鱼来说，一般在4pdf在交配盒中饲养，待一个月大，放置系统进行饲养；

步骤二：在显微注射之前，根据实验需要，将体外合成的mRNA，morpholino，DEPC处理水或质粒与适当比例的酚红按照设置好的浓度配置好；

步骤三：将3％的琼脂糖溶于鱼卵水中，在微波炉里融化，冷却至60摄氏度左右，将大约30ml琼脂糖溶液导入培养皿中，然后将一个特制带有小楔形孔或带有长条的模具置于琼脂糖溶液上面，待其自然冷却，将磨具在琼脂糖表面移走，制得用于单细胞显微注射的平板；

步骤四：先用毛刷将胚胎刷入琼脂糖平板的楔形槽中，在显微镜下用毛刷将胚胎的动物极拨到朝向楔形孔的竖面，显微注射时，将枕头在卵黄一侧刺入，穿过卵黄，直到细胞中心，然后通过脚踩压力板，将溶液注入细胞中，依次将朝向排列正确的胚胎注射完毕，将注射后的胚胎收集在鱼卵水中，培养箱中饲养；

步骤五：将相应时间点的胚胎放入胚胎裂解液中，加入1/40体积的蛋白酶K，混匀后放入55℃杂交炉14小时，然后在94℃变形蛋白K20分钟，吸取1ul作为PCR的模板；

步骤六：诱导系统质粒与Tol2mRNA共注射单细胞时期斑马鱼胚胎，构建转基因鱼群体，然后与野生型斑马鱼交配，进行转基因群体的鉴定，转基因鱼即为F0群体，然后转基因F0群体与野生型交配产生F1群体，在该群体中，部分带有绿色荧光，部分为野生型，将F1群体分成两份，一份加入强力霉素诱导，在胚胎发育时期进行筛选突变体，另一份F1胚胎正常饲养，作为对照组，并饲养成鱼，用于成鱼再生突变体的筛选，在成鱼尾鳍再生突变体筛选过程中，首先将各个品系≥10条转基因鱼药物处理15天，隔天换水，在第十六天进行尾鳍切除手术，并在药物处理下再生10天，筛选再生障碍突变体；

步骤七：最后，突变体的重复及确认，经过F1代胚胎与成鱼突变体的筛选，我们在F2代进行了重复与确认，大致为：F1代具有潜在表型的转基因鱼品系，与野生型交配，产生F2胚胎，利用相同的筛选方法在F2代进行胚胎与成鱼尾鳍再生突变体筛选，对F1代突变体进行确认，并通过其他实验方法验证。

2.根据权利要求1所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，为了防止霉菌产生，在鱼卵水中加入0.03mM亚甲基蓝。

3.根据权利要求1所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，在交配盒中饲养斑马鱼时，向交配盒中的斑马鱼喂食草履虫。

4.根据权利要求1所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤一中，为了降低强力霉素对斑马鱼胚胎的伤害，在该研究中，所有胚胎处理时间为12hpf，药物处理浓度为20-40ug/ml，并置于黑暗处培养，成鱼诱导处理：3个月左右大小的成鱼，在药物浓度60ug/ml的浓度下至少处理15天，并且置于黑暗处饲养，隔天换水，15dpa，取样进行各种实验。

5.根据权利要求1所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤二中，酚红的作用主要是对注射过的胚胎进行标记，避免重复注射。

6.根据权利要求1所述的一种心血管疾病药物筛选斑马鱼动物模型的构建方法，其特征在于：所述步骤六中，在F1胚胎筛选过程中，当筛选到表型时，将转基因鱼挑出，提取基因组，利用LM-PCR方法鉴定插入位置，并进行后续验证工作。