[发明专利]一种基于DNA损伤修复缺陷活细胞彗星检测水体中有机污染物毒性的方法

说明书

本发明公开了一种基于DNA损伤修复缺陷活细胞彗星检测水体中有机污染物毒性的方法，首先采集水样富集物，将所述水样富集物处理DNA损伤修复缺陷活细胞(TDP1KO和TDP2KO)，同时以水样富集物处理的DNA损伤修复正常活细胞(WT)作为对照，结合单细胞凝胶电泳技术，分析测量DNA损伤修复缺陷活细胞和正常细胞的DNA慧星迁移尾矩值，用其评价水体中有机污染物的毒性。本发明的方法提高了水体中有机污染物的遗传毒性检测的灵敏度，能够检测到水中超微量的有机污染物，对环境污染危害健康的预警具有重要的意义，而且还可以从DNA损伤修复角度发掘水中有机污染物生物毒性的分子机制。

技术领域

本发明属于环境健康遗传毒理学领域，具体涉及一种利用DNA损伤修复缺陷活细胞结合单细胞电泳实验技术检测水体中有机污染物毒性的方法。

背景技术

随着人口的增加和现代工农业的高速发展，环境污染问题愈发严重，国内外流行病学调查结果显示自来水和水源水中存在有机污染物，这些有机物可通过水和食物链进入人体，导致人体遗传物质DNA损伤，影响细胞的遗传稳定性，引起孕妇流产、死胎、畸胎和某些遗传性疾病和癌症的发生。因此，对水中有机污染物对细胞DNA毒性检测，并了解这一损伤能否引起细胞遗传物质的变化就显得十分重要。

许多发达国家通常基于细菌或哺乳动物细胞测试系统为基础，用A姆斯法(Amestest)、染色体畸变分析或单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis assay，SCGE)，检测水样中污染物的基因毒性。其中单细胞凝胶电泳又名慧星分析(comet assay)是一个广泛用于真核生物单细胞DNA损伤的量化检测手段。其工作原理是细胞内的DNA受到损伤，改变了DNA超螺旋高级结构，致使其结构松散。如果将细胞包埋到低熔点琼脂糖凝胶中，并将凝胶固定在载玻片上，然后用裂解液破坏细胞膜和核膜，使细胞核DNA及其他成分因膜破坏而进入凝胶，然后在碱性条件下进行电泳，细胞中的大分子核DNA仍会留在原位，若细胞DNA受到损伤，在碱性电泳液(pH＝13)的作用下，DNA由双链解螺旋变为单链，在电流场的作用下，损伤细胞的DNA会向阳极迁移，通过对凝胶细胞DNA染色，在荧光显微镜下能观察彗星拖尾，彗星尾长度与DNA损伤程度成正相关，细胞DNA受损伤程度越高，产生的断链及DNA碎片会越多，荧光检测的彗星尾矩越长和越亮。如果细胞未出现DNA损伤，没有产生的断链及碎片DNA，荧光显微镜观察显示较为规则的圆形荧光团，无拖尾现象。SCGE和其他常用的遗传生态毒理学生物标志物相比，具有简便、快速、灵敏、成本低、效率高等特点。

近半个世纪以来，不同实验室科学家发现和阐明了一些DNA损伤修复的关键基因及其生物学作用，比如TDP1、TDP2、XRCC1、PARP1等基因。其中，TDP1和TDP2分别具有降解蛋白酪氨酸-DNA复合物3'和5'DNA末端的酶活性，参与了多种DNA修复信号转导和修复路径。TDP1可切除拓扑异构酶I介导和氧化损伤引起的3'磷酸和烷基化损伤引起的DNA断裂，而TDP2可修复拓扑异构酶II介导的DNA损伤。

然而，国内外至今还没有关于应用DNA损伤修复缺陷活细胞结合单细胞凝胶电泳实验技术检测水体中有机污染物潜在遗传毒性的技术方法。因此，建立一种高效、快速、灵敏，且能提供有关污染物基因毒性机制信息的测试方法，以此来评价水中有机物的遗传毒性，具有重要的健康意义和社会经济效益。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种高效、快速、灵敏的检测水体中有机污染物毒性的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：

一种基于DNA损伤修复缺陷活细胞彗星检测水体中有机污染物毒性的方法，包括如下步骤：

(1)采集水样富集物，将所述水样富集物处理DNA损伤修复缺陷活细胞，同时以以所述水样富集物处理的DNA损伤修复正常活细胞作为对照；将上述处理的DNA损伤修复缺陷活细胞和正常活细胞分别离心沉淀，再用PBS重新悬浮细胞，离心得到第一细胞悬液，备用；