[发明专利]一种柠檬酸转运蛋白及其在脂质合成中的应用

说明书

本发明公开了一种柠檬酸转运蛋白及其在脂质合成中的应用，属于基因工程以和微生物工程技术领域。本发明的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的柠檬酸‑酮戊二酸转运蛋白具有促进微生物产脂肪酸的功能，将含有本发明柠檬酸‑酮戊二酸转运蛋白的重组高山被孢霉摇床培养7d，可使含有本发明柠檬酸‑酮戊二酸转运蛋白的高山被孢霉的脂肪酸含量达细胞干重的36.1％，较不含本发明柠檬酸‑酮戊二酸转运蛋白的高山被孢霉的脂肪酸含量提升30.4％。本发明通过基因工程手段，在基因层面上提升高山被孢霉等产油微生物的脂质合成累积能力，同时又能保证产油微生物的正常生长，进而为更高效的微生物油脂工业化生产提供技术支持。

技术领域

本发明涉及一种柠檬酸转运蛋白及其在脂质合成中的应用，属于基因工程和微生物工程技术领域。

背景技术

随着健康饮食观念的不断普及，人们对多不饱和脂肪酸的需求不断增加。然而，随着耕地面积的减少及海洋环境的污染，植物、动物及藻类油脂已经无法满足人们的需要。微生物油脂是继植物油脂、动物油脂之后人类开发出的又一种食用油脂。一些产油微生物可积累丰富的多不饱和脂肪酸(PUFAs)，如EPA、AA等。食用适量富含PUFAs的微生物油脂，可明显降低高脂、高胆固醇血症患者血浆内的脂质和胆固醇水平，同时提高血浆内载脂蛋白和高密度脂蛋白水平，因而微生物油脂价值更高。另外产油微生物的适应性强，繁殖速度快，生产周期短，同时也不受场地、气候、季节的影响，一年四季可连续生产；因而微生物油脂作为食用油脂新能源，尤其是保健类功能性油脂，受到研究者越来越多的关注。微生物油脂发酵可能是生物经济的重要研究方向。

随着分子操作技术的发展，微生物油脂的研究已经从发酵工艺优化转向油脂合成积累关键基因的调控。比如苹果酸酶(ME)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)、二酰甘油转移酶(GDAT)、一磷酸腺苷脱氨酶(AMPD)、ATP-柠檬酸裂解酶(ACL)等。而胞质柠檬酸是脂质积累前体物质乙酰辅酶A的主要来源，它还可以增加胞质中乙酰辅酶A羧化酶的活性从而促进脂质合成。外源添加柠檬酸容易改变胞质中的稳态环境，造成产油微生物的生长受到影响。因而从基因层面改变胞质中的柠檬酸含量可以使微生物自身达到一个稳态平衡，进而使更多的柠檬酸用于脂质合成积累，微生物的生长也不会受到影响。

柠檬酸转运蛋白在线粒体柠檬酸往胞质运输的过程中发挥重要的作用，目前只有一株产油含量相对更高的卷枝毛霉WJ11的柠檬酸转运蛋白(CTP)基因在油脂含量相对较低的卷枝毛霉CBS 277.49中过表达，增加了低产油菌株CBS 277.49中的油脂含量。根据目前的报道，微生物中存在两种类型的柠檬酸酸转运蛋白，第一种是CTP，其负责线粒体柠檬酸运输至胞质中的同时将胞质苹果酸运输至线粒体。第二种是柠檬酸-酮戊二酸转运蛋白(YHM)，其负责线粒体柠檬酸运输至胞质中的同时将胞质酮戊二酸运输至线粒体。目前，第二种蛋白YHM还没有在产油丝状真菌中报道出其对脂质合成的影响。

发明内容

鉴于目前对于微生物油脂的需求量日渐增长，而现有的产油微生物的油脂产能并不能满足这一需求，因而如何进一步提高微生物的油脂产能，成为一个迫切需要解决的问题。

为解决上述问题，本发明提供了一种柠檬酸转运蛋白，其特征在于，所述柠檬酸转运蛋白为如下所示任一：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有柠檬酸转运蛋白活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明提供了编码所述的柠檬酸转运蛋白的基因。

在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了携带所述基因的重组质粒。