[发明专利]一种负载外泌体的PET人工韧带及其制备方法

说明书

本发明公开了一种负载外泌体的PET人工韧带及其制备方法，该方法将前处理后的PET人工韧带置于Tris‑HCL溶液中，再加入多巴胺盐酸盐溶液，反应、清洗、干燥后，再置于外泌体悬液中，4‑37℃条件下反应10‑20min，反应结束后，即得所述负载外泌体的PET人工韧带。本发明在PET人工韧带材料表面制备出负载外泌体的功能特异性修饰层，由于外泌体带正电属性，可与带负电荷的聚多巴胺(PDA)发生静电作用，因此所构建的PDA/外泌体修饰层可与PET人工韧带稳定结合，通过该方法，可以显著提高PET人工韧带的生物学性能；材料表面负载的外泌体，可以在植入体内后，通过外泌体自身包含的DNA、RNA、蛋白质等调节靶向细胞内部的蛋白质合成以及启动相关级联反应，促进移植物的宿主整合。

技术领域

本发明涉及生物医学材料技术领域，尤其涉及一种负载外泌体的PET人工韧带及其制备方法。

背景技术

临床常用的聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)人工韧带由于材料自身的疏水性和化学惰性，导致生物活性较差，应用于前交叉韧带重建术后存在滑膜炎、骨道扩大等问题。因此，提高PET韧带的生物学性能，促进人工韧带宿主整合过程显得尤为重要。

外泌体是细胞间传递信号的重要工具，在促进组织修复与再生方面起到了重要的作用。目前已有研究表明，外泌体可以促进肌腱/韧带重建后的愈合过程。然而，现有技术中还没有专门针对人工韧带进行外泌体修饰的方法。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种负载外泌体的PET人工韧带及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

本发明的第一方面是提供一种负载外泌体的PET人工韧带的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，将PET人工韧带置于无水乙醇中浸泡30min以上，然后常温下超声处理5-15min，用去离子水清洗除去乙醇，置于真空干燥箱中至完全干燥；

步骤二，将经步骤一处理后的PET人工韧带置于Tris-HCL溶液中，搅拌使所述Tris-HCL溶液充分浸润所述PET人工韧带，再加入与所述Tris-HCL溶液等体积的多巴胺盐酸盐溶液，反应18-36h后，用去离子水清洗所述PET人工韧带，置于真空干燥箱中至完全干燥，得到聚多巴胺修饰的PET人工韧带；

步骤三，将步骤二所制得的聚多巴胺修饰的PET人工韧带置于外泌体悬液中，4-37℃条件下反应10-20min，反应结束后，即得所述负载外泌体的PET人工韧带。

进一步地，所述外泌体为来源于人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人脂肪干细胞、人肌腱干细胞或人外周血干细胞的分泌物，且含有标志蛋白CD63和HSP70。

进一步地，所述外泌体悬液的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，当所述人骨髓间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人脂肪干细胞、人肌腱干细胞或人外周血干细胞的细胞融合度为70％至80％时，用磷酸盐缓冲液(1x)冲洗，然后在新鲜的无血清培养基中培养48h-60h，以获得第一上清液；

步骤二，将所述第一上清液离心后，弃沉淀得第二上清液；将所述第二上清液离心后，弃沉淀得第三上清液；将所述第三上清液离心后，弃沉淀得第四上清液；所述第四上清液离心后，弃上清液得第一沉淀物；

步骤三，将所述第一沉淀物用磷酸盐缓冲液(1x)重悬后，离心弃上清液得第二沉淀物，重复离心纯化后得纯化外泌体；

步骤四，将所述纯化外泌体悬于磷酸盐缓冲液(1x)中配置成所述外泌体悬液。

进一步优选地，所述外泌体悬液的浓度为20-300μg/ml。

进一步地，所述Tris-HCL溶液的pH为8.0-9.0。