[发明专利]一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法

说明书

本发明公开一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法，包括交联透明质酸钠凝胶制备、羊膜间充质干细胞分离、羊膜间充质干细胞纯化培育、羊膜间充质干细胞提取和交联透明质酸钠干细胞凝胶混合制备五个步骤；本发明通过选择来源广泛、无伦理学限制、低免疫原性、无致瘤风险的hAMSCs作为干细胞成份，搭配透明质酸钠凝胶混合增强hAMSCs粘附、融合的特性，具有良好的生物学功能，且透明质酸钠凝胶具有粘附性，水溶液中可形成网状结构，将子宫内膜创面隔开，以发挥出机械屏障与空间阻隔作用，同时本发明从材料来源、伦理许可、实验操作、预期结果等方面均得到充分的保障，极大地方便产品的转化、规模化生产和后续的临床使用。

技术领域

本发明涉及IUA粘连预防技术领域，尤其涉及一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法。

背景技术

宫腔粘连(IUA)是指由于损伤或感染等原因引起子宫内膜基底层损伤并发生瘢痕愈合，导致子宫腔、子宫峡部和宫颈管腔的宫壁发生部分或全部的粘连，引起宫腔缩小、有效内膜免疫减少、经量减少甚至闭经等症状的临床疾病，近年来IUA已成为导致女性不孕症的重要原因之一，约占不孕症发病因素的8％，同时还与复发性流产、胎儿生长受限、反复胚胎着床失败、胎盘植入部位异常等密切相关；

常用的IUA粘连预防方法包括在宫内放置球囊或节育器、向宫腔内注射透明质酸钠等生物胶、干细胞或人羊膜的宫内移植等，还会辅以雌激素类药物，但常规节育环屏障面积有限且存在嵌顿风险，预防效果不佳；球囊可能压迫宫腔，影响内膜血供和修复过程，影响宫颈机能；单独使用透明质酸钠等生物胶并不能显著改善患者的妊娠结局；雌激素类药物无法物理阻隔宫腔前后壁，且使用存在一定的禁忌症和血栓形成风险，因此IUA的预防和术后再粘连问题仍未得到根本改善，本发明提出一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法以解决现有技术中存在的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提出一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法，该宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法通过选择来源广泛、无伦理学限制、低免疫原性、无致瘤风险的hAMSCs作为干细胞成份，搭配透明质酸钠凝胶混合增强hAMSCs粘附、融合的特性，具有良好的生物学功能，且透明质酸钠凝胶具有粘附性，水溶液中可形成网状结构，将子宫内膜创面隔开，以发挥出机械屏障与空间阻隔作用，同时本发明从材料来源、伦理许可、实验操作、预期结果等方面均得到充分的保障，极大地方便产品的转化、规模化生产和后续的临床使用。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案实现：一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、在超声条件下，向透明质酸钠的碱性水溶液中滴加交联剂反应，反应结束后用酸碱调节剂调节pH值在6.8-7，然后加入有机溶剂沉淀后得到交联透明质酸钠凝胶备用；

步骤二、获取新鲜羊膜，将新鲜羊膜剪碎至1毫米大小的碎片后，加入0.25％胰蛋白酶中进行消化处理两次，然后再加入Ⅱ型胶原酶再次进行消化处理，分离出羊膜间充质干细胞；

步骤三、收集消化处理后的新鲜羊膜细胞滤液并离心处理，得到提纯后的羊膜间充质干细胞hAMSCs，然后将hAMSCs重悬于含10％胎牛血清的DMEM/F12的培养基中，置于37℃孵箱中恒温孵育；

步骤四、当hAMSCs细胞融合达到80％时，再次用0.25％胰蛋白酶消化处理，使用3～5代生长状态好的hAMSCs进行1:3传代，提取传代培育后的hAMSCs备用；

步骤五、将提取的hAMSCs加入交联透明质酸钠凝胶中混合均匀，得到交联透明质酸钠干细胞凝胶。

进一步改进在于：所述步骤一中的超声条件为在18～30℃温度条件和20-40kHz超声频率下超声30分钟，酸碱调节剂调节后还需平衡搅拌90～100分钟。

进一步改进在于：所述步骤一中交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE，交联反应时将物料在30～50℃环境下保温4小时并持续搅拌。