[发明专利]一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法

权利要求书

1.一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤一、在超声条件下，向透明质酸钠的碱性水溶液中滴加交联剂反应，反应结束后用酸碱调节剂调节pH值在6.8-7，然后加入有机溶剂沉淀后得到交联透明质酸钠凝胶备用；

步骤二、获取新鲜羊膜，将新鲜羊膜剪碎至1毫米大小的碎片后，加入0.25％胰蛋白酶中进行消化处理两次，然后再加入Ⅱ型胶原酶再次进行消化处理，分离出羊膜间充质干细胞；

步骤三、收集消化处理后的新鲜羊膜细胞滤液并离心处理，得到提纯后的羊膜间充质干细胞hAMSCs，然后将hAMSCs重悬于含10％胎牛血清的DMEM/F12的培养基中，置于37℃孵箱中恒温孵育；

步骤四、当hAMSCs细胞融合达到80％时，再次用0.25％胰蛋白酶消化处理，使用3～5代生长状态好的hAMSCs进行1:3传代，提取传代培育后的hAMSCs备用；

步骤五、将提取的hAMSCs加入交联透明质酸钠凝胶中混合均匀，得到交联透明质酸钠干细胞凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤一中的超声条件为在18～30℃温度条件和20-40kHz超声频率下超声30分钟，酸碱调节剂调节后还需平衡搅拌90～100分钟。

3.根据权利要求1所述的一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤一中交联剂为1,4-丁二醇二缩水甘油醚BDDE，交联反应时将物料在30～50℃环境下保温4小时并持续搅拌。

4.根据权利要求1所述的一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤二中的新鲜羊膜是从剖宫产手术中的羊膜组织中获取，用0.25％胰蛋白酶消化处理每次处理时间为30分钟，用Ⅱ型胶原酶消化处理时间为1小时。

5.根据权利要求1所述的一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤三中细胞滤液是经过滤后的细胞滤液，再将细胞滤液经转速1200r/min离心10分钟的离心处理纯化。

6.根据权利要求1所述的一种宫腔用交联透明质酸钠干细胞凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤三中的DMEM/F12的培养基还包含了100U/mL青链霉素，有效抗菌减少细胞被污染的概率，促进细胞分裂和增值，步骤二中恒温孵育时培养液每2天更换一次。