[发明专利]一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法

说明书

本发明涉及药物敏感性检测领域，具体为一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，步骤包括：S1、工作液的制备；S2、分别用替代液和利福平工作液对分析菌液处理10天或14天；S3：将经过处理的菌液分别进行染色；S4：对染色后的菌液分别进行检测，记录各菌液的平均荧光强度值，并计算其敏感指数，并根据敏感指数判断其对利福平的敏感性：当敏感指数大于临界值时判断所检结核分枝杆菌为异质性耐药结核分枝杆菌或耐药结核分枝杆菌；当敏感指数低于临界值时判断为敏感菌；临界值范围为0.48或0.37。本发明方法准确度较高，10天即可快速获得结核分枝杆菌利福平异质性耐药的检测结果，高准确率、敏感性和特异性。

技术领域

本发明涉及药物敏感性检测领域，特别是涉及一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法。

背景技术

流式细胞术具有高通量、多参数、高效等优点，越来越多的被应用于微生物药敏检测。检测细菌药物敏感性的本质是监测细菌在药物处理后的活力，流式细胞术正是通过监测不同状态下的细菌与荧光染料作用后荧光值的差异来反应细菌活力的。敏感菌经抗生素作用后活力下降，耐药菌活力则无变化，如果不同活力或功能状态的微生物与特定的荧光染料结合后会发出不同强度的荧光，则通过检测荧光强度的变化即可判断细菌的药敏信息。荧光素双醋酸酯是一种具有细胞膜透性的疏水荧光素衍生物，当进入细胞后可被细胞内的酯酶催化水解生成发绿色荧光的荧光素，不具有完整细胞膜或新陈代谢活性弱的死细胞因酯酶失活而不能水解荧光素双醋酸酯，因此荧光素双醋酸酯常被用于细胞活力的检测。目前基于这类染料的流式细胞术逐渐成为白色念珠菌、结核分枝杆菌、金黄色葡萄球菌等微生物药物敏感性快速检测的方法之一。

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis， MTB)，是结核病的病原体，目前仍是全球最主要的公共卫生问题之一。近年来，由于用药不合理、其他药物使用的副作用或食品安全、环境等因素导致人类群体免疫力下降等原因，MTB快速地表现出了耐药性，且有增强趋势。在尚未有新药问世的情况下，准确的耐药性检测成为了治疗MTB引起的结核病的重要辅助环节。目前也已经有很多学者在做这方面的研究。

异质性耐药是一种特殊的耐药现象。虽然目前耐药性检测技术已经趋于成熟，比如传统的比例法DST是可靠性强和灵敏度高的检测耐药的方法，但是要检测并得到病原菌的异质性耐药情况，就目前的技术而言，则必须依赖基因学检测技术。但基因学检测存在只能检测与表型明确相关的耐药基因突变，无法识别未明确的耐药基因的缺陷，最终会影响检测准确率，使检测结果的临床参考价值降低。

目前，尚未见其他更准确、便捷的技术手段有效地应用于结核分枝杆菌异质性耐药检测中。

发明内容

基于此，本发明的目的在于，提供一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，利用基于荧光素双醋酸酯的流式细胞术，检测结核分枝杆菌的利福平异质性耐药，其原理基于表型，但大大缩短了检测时间，比比例法和绝对浓度法快速、高效，比基因型法准确。而且由于其基于表型，不依赖于耐药基因是否明确，因此除了利福平，也可以拓展应用于结核分枝杆菌其它药物的异质性耐药检测。

本发明的技术方案如下：

一种基于荧光素的流式细胞术鉴定结核分枝杆菌利福平异质性耐药的方法，其步骤包括：

S1、工作液的制备：分别制备荧光素双醋酸酯染色液、利福平工作液和结核分枝杆菌分析菌液；

S2、对分析菌液进行药物处理：将分析菌液分为对照组和试验组，分别用替代液和利福平工作液对对照组和实验组的分析菌液处理10～14天；

S3：将S2中经过处理的结核分枝杆菌菌液分别进行染色；

S4：分别进行检测，记录各菌液的平均荧光强度值，并计算其敏感指数，再根据敏感指数判断其对利福平的敏感性；