[发明专利]一种几丁质内切酶CmChi4及其克隆表达与应用

说明书

本发明公开了一种几丁质内切酶CmChi4及其克隆表达与应用。通过基因工程手段将几丁质酶基因CmChi4构建在质粒pCOLDI上，并转入E.coli BL21(DE3)中表达，该重组酶分子量大小为72.1kDa。对CmChi4酶学性质研究表明，在温度50℃、pH为6时活力最佳；Fe²⁺、K⁺、Al³⁺和Zn²⁺对酶CmChi4具有较强的激活。此外，几丁质内切酶CmChi4水解胶体几丁质的产物为(GlcNAc)₂、(GlcNAc)₃和(GlcNAc)₄，稳定性好，适合产业化。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种几丁质内切酶CmChi4及其克隆表达与应用。

背景技术

几丁质（Chitin）分子式为(C₈H₁₃O₅N)_n，是由N-乙酰氨基葡萄糖（N-acetyl-D-glucosamine，GlcNAc）通过β-1,4-糖苷键连接而成的多聚物。几丁质作为一种重要的生物质资源，在地球上的含量仅次于纤维素，年自然合成量约为10¹¹吨。它广泛存在于海洋生物虾蟹贝类的外壳、昆虫外骨骼及真菌细胞壁中。然而，数量庞大的甲壳资源至今没能得到良好的利用，通常都被当作废弃物肆意堆积堆积或丢弃，造成环境污染及空间资源的浪费。近年来，甲壳资源的高效绿色炼制已作为科研热点逐渐被提上议程。

几丁寡糖是几丁质炼制的重要产物，被广泛应用于抗肿瘤药物的开发制备研究，同时也作为重要的饲料添加剂广泛应用于食品、饲料等领域。目前制备几丁寡糖的传统方法为酸水解法，该过程具有反应剧烈、反应条件苛刻、环境污染大、产物聚合度不可控、产品生物活性差等缺陷，强酸的使用又为后续处理增加成本，严重违背绿色可持续发展的战略国策。生物酶法降解几丁质制备几丁寡糖因其反应温和、过程绿色、产品生物活性好，且高效利用废弃甲壳资源等优势，已逐步成为生物质多糖炼制的热点研究。

几丁质酶在生物界分布广泛，按切割糖苷键的方式的不同可分为外切几丁质酶，内切几丁质酶及N-乙酰葡萄糖苷酶。外切几丁质酶从几丁质糖链非还原末端将几丁质降解为(GlcNAc)₂，内切几丁质酶可随机作用于几丁质长链的任何一个糖苷键，并将其水解成几丁寡糖；而N-乙酰氨基葡萄糖苷酶可水解几丁寡糖为GlcNAc。论文“来源于苜蓿链霉菌的糖苷水解酶19家族几丁质酶的性质研究与应用”中报道了一个具有高活性的内切几丁质酶SaChi19B，在组合了一个N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的作用下，降解几丁质6h得到较高产率的GlcNAc；专利CN111996205A 公开了一种利用毕赤酵母表达几丁质内切酶制备几丁寡糖的方法，该方法通过甲醇诱导120h过表达几丁质酶，发酵成本较高且周期较长，不适合产业化。

因此，挖掘具有更多高酶活的新型几丁质内切酶对于几丁寡糖的高效炼制具有重要意义。

发明内容