[发明专利]生物发光工程化细菌组合物及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了一种生物发光工程化细菌组合物及其制备方法与应用。本发明的生物发光工程化细菌组合物，包括生物发光工程化细菌、发光底物、光敏剂分子以及可以原位成胶的生物高分子。本发明还公开了上述生物发光工程化细菌组合物在肿瘤光动力治疗以及免疫治疗中的应用。本发明通过将表达萤火虫荧光素酶的质粒转染至减毒的沙门氏杆菌中，构建了生物发光工程化细菌，该菌与底物D‑荧光素共孵育时能够产生波长为540‑600nm的黄绿色光，进而激发Ce6产生单线态氧实现肿瘤的光动力治疗；同时，该工程化细菌可以作为免疫佐剂激活机体抗肿瘤免疫反应，增效肿瘤光动力治疗，实现对肿瘤的高效协同治疗。

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗制剂领域，尤其涉及一种生物发光工程化细菌组合物及其制备方法与应用。

背景技术

肿瘤光动力治疗光动力治疗(Photodynamic Therapy，简称PDT)是上个世纪七十年代末开始形成的一项肿瘤治疗新技术，具有选择性强、可重复治疗、微创、无累积毒性、疗效好等优点，在美、英、法、德、日等不少国家已经获得国家政府相关部门的正式批准，成为治疗肿瘤的一项常规手段，可用于多种肿瘤的治疗如皮肤癌、前列腺癌和乳腺癌等。光动力治疗主要包括三个要素：光敏剂、激发光源和氧气。在特定波长的激发光照射下，光敏剂分子可以将能量转移给氧气，产生具有细胞毒性的活性氧簇。在光动力治疗中，光的能量和组织穿透深度决定了光动力治疗对深层组织的治疗效果。目前临床上批准使用的光敏剂大部分的激发波长处于紫外光区或者可见光区，常用于浅表部位的肿瘤，对深部组织的肿瘤穿透深度有限，而且体内组织发色团，如血红蛋白、黑色素、脂肪等对可见光发生强烈的光吸收和光散射，导致可见光的衰减，限制了可见光的组织穿透能力。因此开发既能产生足够的能量又能增加组织穿透深度的光动力治疗方法具有极其重大的意义。

生物发光是利用生物发光能量转移系统通过生物化学反应(如催化反应)激活生物发光蛋白，产生内源性的光源，已被广泛用作体外和体内实时光学成像和定量检测。

细菌的抗肿瘤机制包括内毒素产生的固有抗肿瘤作用、肿瘤细胞因营养缺乏而产生的坏死以及触发机体产生肿瘤细胞特异性的抗肿瘤免疫。但是，由于野生型的细菌注射到人体会产生严重的毒副作用，甚至会导致病人死亡。因此，目前常通过基因工程手段来敲除细菌体内与毒性相关的基因来降低细菌的毒副作用，但这又会大大降低细胞的抗肿瘤效果，单独的细菌治疗无法有效消除肿瘤。为了进一步提高减毒细菌的抗肿瘤效果，大量研究常利用减毒细菌作为药物载体向肿瘤部位递送药物，或通过合成生物学的手段在肿瘤部位原位表达具有细胞毒性的细胞因子等，但这些组合的治疗效果仍不够理想。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种生物发光工程化细菌组合物及其制备方法与应用，本发明的生物发光工程化细菌表达的萤火虫荧光素酶在接触并催化其底物D-荧光素后可以产生激活态的氧化荧光素，同时产生波长为540-600nm的黄绿色光，激发Ce6产生单线态氧实现肿瘤的光动力治疗，同时该工程化细菌可以作为免疫佐剂激活机体免疫反应，进而增效肿瘤光动力治疗。

本发明的第一个目的是提供了一种生物发光工程化细菌组合物，包括：

a)工程化细菌，所述的工程化细菌表达荧光素酶，宿主为减毒的沙门氏菌、大肠杆菌、李斯特菌中的一种或多种；以及，

b)发光底物，所述的发光底物在荧光素酶催化下可产生激活态氧化荧光素；以及，

c)光敏剂分子，所述的光敏剂分子在激活态氧化荧光素作用下可产生具有细胞毒性的单线态氧分子；以及，

d)生物高分子，所述的生物高分子可原位成胶。

进一步地，所述的发光底物为D-荧光素、D-荧光素钾盐、D-荧光素钠盐中的一种或多种。

进一步地，所述的光敏剂分子为二氢卟吩e6(Ce6)、原卟啉(protoporphyrin IX，PpIX)、中一种或多种。