[发明专利]一种用于常温快速检测新型冠状病毒的扩增体系及其应用

说明书

本发明公开了一种用于常温快速检测新型冠状病毒的扩增体系及其应用，属于生物技术领域。本发明以新型冠状病毒中S基因的全部序列为检测靶点，通过RPA扩增技术，筛选出了特异性的引物对和探针组合，提高了新型冠状病毒的检测便捷性和特异性，极大缩短了检测时间。本发明还提供了一种利用上述引物对和探针进行的扩增体系的检测方法，该方法检测灵敏度高，检出限低，耗时短。本发明提供的方法的反应温度为35～42℃，对温度要求不高，能适用于现场及野外测试。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于常温快速检测新型冠状病毒扩增体系及其应用。

背景技术

目前筛查和诊断新型冠状病毒(SARS-COV-2)的主要手段是实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)。qPCR是在常规PCR的基础上加入荧光探针或相应的荧光染料来实现实时定量的。qPCR检测结果受到样本的运输、核酸提取、基因突变和试剂盒稳定性影响，极易造成漏检或者误检。且qPCR技术需要借助大型仪器，设备维护费用高，机器设置操作复杂，需要专业人员进行操作，不能用于现场快速检测。

重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase Amplification,RPA)是近年来备受关注且迅速发展的常温扩增技术，其依赖T4噬菌体核酸复制机制，利用重组酶、单联DNA结合蛋白和DNA常温聚合酶的参与实现了靶基因在常温环境中的快速扩增，20min 内能够将目标核酸扩增至可检测的水平，操作简单、快速高效，能偶联其他方法进行联合读取结果，是目前最有希望替代PCR扩增技术的新型核酸检测方法。现有的RPA技术也存在很多应用难点，相关产品以LFD-RPA及EXO-RPA为主要检测模式，但是仍依赖于实验室操作，对于扩增反应要求非常高，同时也依赖于恒温扩增仪等必备仪器。

现场检测对扩增体系的要求需要体系反应过程尽可能的脱离仪器依赖，目前，RPA扩增反应尚不能适应不同的检测样品，受到扩增环境的影响较大，未达到现场检测的要求。要实现RPA基因扩增的现场检测，还必须克服实验体系的实施和检验过程具有一定的技术难度，降低人为操作因素，减少人为误差，尽可能的将检测流程自动化和可控化。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了一种特异性的引物对、探针组合，并以此为基础建立RPA扩增体系，将该扩增体系应用于现场检测中，扩增产物与胶体金试纸显色反应，从而脱离仪器依赖，准确、快捷、迅速检测是否感染新型冠状病毒。本发明通过以下技术方案实现：

本发明提供一种用于常温快速检测新型冠状病毒的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5所示。

优选地，所述引物对为SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4/SEQ ID NO： 5。

本发明还提供可一种用于常温快速检测新型冠状病毒的探针，所述探针长度为46～52bp，5′端有带抗原标记的寡核苷酸作为标签；3′端有阻断基团；所述探针中部设计有一个四氢呋喃替代的脱碱基位点THF，所述位点THF距离3′端至少有15bp，距离5′端至少有30bp。

优选地，所述带抗原标记的寡核苷酸为FAM基团；所述阻断基团为为C3 spacer。

优选地，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了上述引物对和探针在检测新型冠状病毒中的应用。

优选地，所述引物对为SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：2，所述探针为SEQ ID NO：3；或者所述引物对为SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：5，所述探针为SEQ ID NO：6。

进一步地，本发明的引物对和探针的组合可以有如下2种组合：